Этаноламиды жирных кислот: биосинтез
Первые сообщения о синтетической активности тканей млекопитающих по отношению к этаноламидам ЖК появились задолго до того, как установили их роль в качестве эндогенных лигандов каннабиноидных рецепторов. Было обнаружено два пути их образования: синтез из свободной ЖК и этаноламина и гидролиз N-ацилфосфатидилэтаноламинов ( рис. 2 ). До начала 90-х годов большая часть работ была посвящена амидам насыщенных и моноеновых кислот. Для этаноламидов большинства полиненасыщенных ЖК обе возможности синтеза были подтверждены в середине 90-х гг.
При изучении синтеза фосфатидилэтаноламина с помощью [14С]этаноламина было обнаружено, что препараты микросом печени крыс способны включать метку в липид, который был идентифицирован как N-ацилэтаноламин [ Colodzin, ea 1963 ].
Синтез протекал с насыщенными и ненасыщенными ЖК с длиной цепи от 12 до 24 углеродных атомов. Амидные производные не образовывались, когда в качестве аминов использовали холин и различные аминокислоты, однако наблюдалось N-aцилирование фениламина, N-оксифениламина и 1-амино-2-пропанола [ Colodzin, ea 1963 ].
Исследование других биологически активных аминов как субстратов той же ферментативной системы показало, что пальмитиновая кислота образует амиды с гистамином, тирамином, фенэтиламином и триптамином, но не с норадреналином или серотонином [ Bachur, ea 1963 ].
Наибольшая активность синтеза N-ацилэтаноламинов обнаруживается в гомогенатах печени , мозга и почек с преобладанием в микросомальной фракции, хотя и в присутствии митохондрий синтез протекает достаточно активно. Из насыщенных жирных кислот лучшими субстратами оказались миристиновая, пальмитиновая и стеариновая, из ненасыщенных - олеиновая и линолевая [ Bachur, ea 1996 , Bachur, ea 1965 , Stoffel, ea 1980 , Morell, ea 1970 , Schmid, ea 1985 ] ( рис. 2 ).
Синтез этаноламидов полиненасыщенных ЖК также наблюдается при инкубации с гомогенатами различных тканей млекопитающих [ Deutsch, ea 1993 , Kruszhka, ea 1994 ].
Было показано, что микросомальные и цитозольные препараты различных тканей кролика обладают синтетической активностью по отношению к этаноламидам насыщенных и ненасыщенных ЖК [ Kruszhka, ea 1994 ].
Синтез ANA лучше всего протекал с микросомами мозга и менее активно - с микросомами почек, печени и легких. Среди цитозольных фракций исследованных тканей существенная синтетическая активность была обнаружена только в цитозоле мозга. Арахидоновая кислота оказалась лучшим субстратом как для мембранных, так и для цитозольных препаратов мозга среди всех исследованных кислот. Селективность ферментативной системы по отношению к ней оказалась более чем 50-кратной при сравнении с пальмитиновой. Синтез является АТР- и СоА-независимым, что было ранее отмечено также для синтеза PEA микросомами печени крыс [ Bachur, ea 1996 ].
Эти данные были подтверждены на примере синтеза этаноламидов различных ЖК на мембранах мозга быка. По кинетическим параметрам субстраты можно расположить в следующем ряду в порядке убывания: арахидоновая > дигомо-g-линоленовая, 11,14-эйкозадиеновая > пальмитиновая > адреновая, докозагексаеновая кислота. Наибольшая синтетическая активность была обнаружена в гипоталамусе, меньшая - в таламусе, полосатом теле, коре и наименьшая - в мозжечке и продолговатом мозге [ Devane, ea 1994 ]. Значения константы Михазлиса для обоих субстратов синтетазной реакции были достаточно высоки и составили для ферментной системы из микросом мозга кролика [ Kruszhka, ea 1994 ] и крысы [ Sugiura, ea 1996 ] соответственно для этаноламина 130 и 135 мМ, для арахидоновой кислоты - 7 и 100 мкМ. Это свидетельствует о том, что для синтеза ANA из арахидоновой кислоты и этаноламина необходимо существенное локальное повышение их уровня или высвобождение из предшественников, например под действием PLA2 и PLD.
Альтернативный путь синтеза этаноламидов ЖК гидролизом соответствующих N-ацилфосфатидилэтаноламинов был открыт при исследовании инфарктного сердца собаки. Накопление в пораженных участках миокарда как N-ацилэтаноламинов, так и его предшественника - АРЕ , а также соотношение радиоактивного этаноламина в этих липидах при инкубировании c ним ткани сердца привело исследователей к заключению, что первые образуются из вторых [ Epps, ea 1979 , Epps, ea 1980 , Natarajan, ea 1981 ] под действием специфической фосфолипазы.
Фермент, катализирующий гидролиз АРЕ , был также обнаружен в мозге крысы [ Schmid, ea 1983 ]. Он оказался активен в широком диапазоне pH - от 4,5 до 8,5 и не требовал Са2+ или других двухвалентных катионов, но ингибировался Zn2+. Соли желчных кислот и другие ионные детергенты ингибировали действие фермента, а тритон Х-100 активировал реакцию. Фермент расщеплял диацильную и плазмалогенную формы АРЕ и лизо-АРЕ, но не действовал на фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. Таким образом, было показано, что по субстратной специфичности, как и по отношению к ингибиторам и активаторам, обнаруженная фосфолипаза отличается от PLD, ранее найденной в мозге и других тканях млекопитающих [ Saito, ea 1975 , Chalifour, ea 1980 ].
Позднее было подтверждено существование в мозге крыс [ Natarajan, ea 1986 ] и собак [ Natarajan, ea 1984 ] ферментативного механизма, приводящего к образованию этаноламидов ЖК из экзогенного АРЕ.
В работах 70-х годов не было отмечено образования этаноламидов полиненасыщенных жирных кислот, а АРЕ, обнаруженные в тканях млекопитающих, несли в N-положении главным образом насыщенные кислоты, тогда как этаноламиды полиненасыщенных ЖК с числом атомов более 18 не были зарегистрированы [ Epps, ea 1980 , Matsumoto, ea 1973 , Gray, ea 1976 ].
Синтез ANA из соответствующего АРЕ впервые был описан в первичной культуре нейронов мозга крысы в 1994 г [ Di Marzo, ea 1994 ]. Ингибиторы PLA2 ( диметилэйкозадиеновая и октадецилбензоакриловая кислоты ) и PLC ( неомицин ) не оказывали эффекта на стимулированное иономицином образование ANA, так же как и добавление арахидоновой кислоты к интактным нейронам, инкубированным с экзогенной PLD, что свидетельствует о том, что в клетках не происходила конденсация свободной кислоты с этаноламином. С другой стороны, для образования анандамидов в нестимулированных клетках существенно добавление экзогенной PLD (но не PLA2 и PLC), а инкубация синтетического [3H]N-apaхидоноилфосфатидилэтаноламина и других АРЕ с гомогенатом нейронов также приводила к образованию ANA и его аналогов, что подтверждает существование PLD-зависимого образования ANA [ Di Marzo, ea 1994 ].
