Рецепторы кардиогликозидов Na+,К+-АТФазы: доменная локализация
Поскольку размеры молекулы сердечных гликозидов соизмеримы с размерами внеклеточной области Na+,К+-АТФазы, не исключено, что модификации могут подвергаться также компоненты мембраны, выходящие за границы рецепторной зоны [ Модянов ea 1988 ]. Действительно, ковалентное включение метки исключительно в а-субъединицу происходило лишь в случае, если расстояние между центром лактонного кольца и реактивной группой не превышало 23 А [ Deffo ea 1983 , Rogers ea 1979 , Rossi ea 1980 , Ruoho ea 1974 ].
Следовательно, стероидная часть в молекуле ингибитора и, вероятно, первый углеводный остаток взаимодействуют исключительно с внеклеточными доменами каталитической субъединицы, которые и составляют основную часть рецептора сердечных гликозидов [ Модянов ea 1988 ]. Фотоактивируемые аналоги дигитоксина , которые содержат реактивную группу на третьем углеводном остатке (3'"- и 4"'-диазомалонилдигитоксины), модифицируют наряду с а- также и (b-субъединицу фермента [ Hall ea 1980 ]. Это предполагает пространственную близость данного локуса рецептора сердечных гликозидов на каталитической субъединице с (b-субъединицей [ Модянов ea 1988 ].
Применение методов молекулярной биологии открыло новые возможности для выяснения структурных основ чувствительности Nа+,К+-АТФазы к сердечным гликозидам ( рис 1 ).
Интродукция рецепторных свойств изоформ каталитической субъеднницы фермента при трансфекции их кДНК в клетки с противоположным типом чувствительности к ингибитору по отношению к экзогенной Nа+,К+-АТФазе подтвердила достаточность а-субъединицы для обеспечения характера чувствительности к уабаину [ Emanuel ea 1988 , Hara ea 1988 , Kent ea 1987 , Kolansky ea 1992 , Takeyasu ea 1988 ].
В экспериментах по экспрессии химерной al-субъединицы Na+,К+-АТФазы уабаин-чувствнтельных и резистентных видов (крыса/овца [ Price ea 1988 ], Torpedo/крыса [ Noguchi ea 1988 ]) или химеры а-субъединнцы Na+,К+-АТФазы/ Са2+-АТФазы [ Ishi ea 1993 ] выявлено, что детерминанты, определяющие характер чувствительности к уабаину, локализованы в N-концевой области каталитической субъединицы фермента (HI - Н4) [ Lingrel ea 1991 ], предположительно между мембранными сегментами HI и Н2 [ Noguchi ea 1988 , Price ea 1988 ].
Однако после создания химерных молекул каталитической субъединицы Н+,К+-АТФа-зы /Na+,К+-АТФазы стало очевидным, что рецептор сердечных гликозидов имеет более сложную организацию и включает также внеклеточные домены С-концевой области а-субъединицы Nа+,К+-АТФазы [ Blostein ea 1993 ]. Подтверждения этому получены также в исследованиях с некоторыми фотоаффинными аналогами уабаина: включение метки имело место как в N-концевом (46 кДа), так и в С-концевом (58 кДа) фрагментах после трипсинового гидролиза Nа+,К+-АТФазы [ Goeldner ea 1983 , Jorgensen ea 1982 ].
Сопоставление аминокислотных последовательностей предполагаемых внеклеточных доменов каталитической субъединнцы Na+,K+-ATФaзы с разным типом чувствительности к сердечным глпкозидам показало, что уникальными для резистентной к уабаину al-изоформы фермента крысы являются лишь находящиеся в примембранных позициях сочленения между мембранными сегментами Н1 и Н2 полипептидной цепи заряженные аминокислоты Арг-113 и Асп-124 [ Hara ea 1987 ].
Все уабаинчувствительные формы Na+,K+- АТФазы с установленной аминокислотной последовательностью в пограничных позициях эктодомена Н1-Н2 содержали незаряженные аминокислоты Глн п Асн (a1 -изоформа почек овцы [ Shull ea 1985 ], свиньи [ Ovchinnikow ea 1986 ], клеток HeLa [ Kawakami ea 1986 ], фермент электрического органа Torpedo [ Kawakami ea 1985 ], аЗ-изоформа мозга крысы [ Shull ea 1986 ]) или Лей и Тре вместо Глн в а2-субъединице Na+,K+-АТФазы из мозга крысы [ Shull ea 1986 ] или al-субъедннице Ка+,К+-АТФазы цыпленка [ Takeyasu ea 1988 ] соответственно.
С помощью сайт-направленного мутагенеза стало возможным изучение роли конкретных аминокислот в связывании уабаина (по степени уменьшения сродства к уабаину модифицированного, но функционально активного гликозидчувствительного фермента при его экспрессии в уабаинчувствительных клетках [ Lingrel ea 1994 ].
Одновременная замена пограничных аминокислот эктодомена Н1-Н2 уабаннчувствнтельноп al-изоформы Na+,K+-АТФазы овцы на таковые резистентнон к уабанну al-изоформы фермента крысы (Глн-111 на Apr и Асн-122 на Асп) сопровождается формированием резистентности к уабаину у мутантного фермента, которая аналогична резистентностп al-изоформы крысы ( рис 1 ) [ Price ea 1988 ].
На участие домена Н1-Н2 в связывании кардиоактивных стероидов указывают также результаты изучения ингибиторной способности структурных аналогов сердечных гликозидов (с заменами в положении С-17 стеропдного ядра), согласно которым лактонное кольцо взаимодействует с анионным участком рецептора [ Thomas ea 1974 ].
Исследования с флуоресцентными [ Fortes ea 1977 ] и фотоактивируемыми [ Goeldner ea 1983 ] аналогами сердечных гликозидов свидетельствуют, что часть участка связывания ингибитора гидрофобна и может содержать Трп. Показано, что мишенью ковалентной модификации некоторыми фотоактивируемыми аналогами уабанна является непосредственно аминокислотная последовательность, соответствующая эктодомену НЗ-Н4 [ Ahmed ea 1987 ], в частности Трп-319 (нумерация для фермента из ооцитов Хеnopus laevis) [ McParland ea 1991 ]. Обнаружена высокая консервативность этого эктодомена каталитических субъедннпц Na+K+-ATФазы из разных источников и его гомология с аминокислотными последовательностями стероидсвязывающих участков рецептора эстрогена и рецептора глюкокортнкоидов [ Baker ea 1986 ].
Функциональная значимость эктодомена НЗ-Н4 для реиепции сердечных гликозидов была подтверждена в последующих исследованиях, согласно которым мутация Тир-317 (X. Laevis) обеспечивала резистснтность к уабаину [ Canssa ea 1993 ]. В то же время в исследованиях Лингрелл и соавт. [ Lingrel ea 1991 ] мутация остальных аминокислот (кроме Тир и Лей) домена НЗ-Н4 (Глу-Тир-Тре-Трп-Лей-Глу), в том числе Трп, не изменяла чувствительности al-изо-формы Na+,K+-ATOФaзы овцы к уабаину.
На основании приведенных данных была сформулирована рабочая модель связывания кардиогликозидов Na+,К+-АТФазой
