Ca2+-ATPазы плазматических мембран: молекулярная структура
Трансмембранные домены (ТМ) образованы гидрофобными a-спиралями ( рис. 6.10 ). a-cпиральные структуры С- конца могли бы образовывать одиннадцатый ТМ, однако, последние данные полученные в результате рентгеноструктурного анализа свидетельствуют только о десяти трансмембранных доменах [ Toyoshima, C., Nakasako, M., ea, 2000 ]. Первые пять a-спиралей выступают в цитоплазму, образуя так называемый "стебель". В белке имеются два длинных цитоплазматических фрагмента между 2 и 3 ТМ и между и 5 ТМ, образуемые в основном b-слоями с некоторым количеством a-спиралей. Первый b-домен соответствует "трансдуцирующему" домену других ATPаз Р-типа, который по мнению некоторых авторов сопрягает гидролиз ATP с переносом Ca2+, хотя механизм этого сопряжения остается непонятным. Мутации в консервативных участках этого домена приводят к ингибированию перехода Е1-Е2. Этот домен имеет низкоаффинный сайт связывания АТР, Рi, и ванадата, и вероятно играет регуляторную роль в активности Са2+-ATPазы. Второй b-складчатый домен содержит сайт фосфорилирования Asp-75 в PMCA 1b (Asp-351 в SERCA 1a) с окружающими аминокислотами консервативным почти во всех АТРазах Р-типа. В этом домене имеется также высокоаффинный сайт связывания АТР и сайт связывания ингибитора Са2+-ATPаз флуоресцин-5'-изотиоционата ( FITC ). В С-терминальной части этого домена имеются две a-спирали, между которыми происходит сгибание (так называемый "шарнир"), при переносе связанной АТР к месту ее гидролиза.
Са2+ АТРаза плазматической мембраны имеет Kd= 0.2 мкМ. Na\Ca обменник плазматической мембраны в сердце Kd= 0.5-1 мкМ.
Характерной особенностью фермента из плазматических мембран является его активация кальмодулином (КМ) , который увеличивает сродство АТРазы к Ca2+ и максимальную скорость реакции. Активация происходит в результате непосредственного взаимодействия фермента с КМ, что позволило выделять Ca2+-АТРазу плазматических мембран методом аффинной хроматографии на иммобилизованном КМ. В первом b-складчатом домене в АТРазах типа PMCA содержится участок фермента, чувствительный (или рецепторный) к действию "автоингибиторного" СаКМ-связывающего участка. На С-терминальном "хвосте" расположен СаКМ-связывающий участок, взаимодействие которого с рецепторным участком приводит к ингибированию Са2+-ATPазы. При связывание СаКМ (также как и делеции СаКМ-связывающего участка) Са2+- ATPаза становиться постоянно активной, вследствие разобщения СаКМ- связывающего участка и его рецепторного сайта. В гепатоцитах обнаружена изоформа PMCA с большей молекулярной массой и нечувствительная к КМ [ Lotersztajn, S., ea, 1981 ]. СаКМ-связывающий участок окружен регионами с отрицательными зарядами, функция которых не выяснена, но которые могли бы представлять Са2+- связывающие сайты. АТРазы типа PMCA имеют сайты фосфорилирования РКА и РКС . Сайт фосфорилирования АТРазы РКС лежит на СаКМ связывающем участке. Показано, что фосфорилирование Са2+- АТРазы плазмалеммы PKC и PKA повышает ее активность. В сарколемме сердца, скелетных мышц и в плазматических мембранах эритроцитов АТРаза активируется путем фосфорилирования сАМР-зависимой протеинкиназой.
Известно четыре гена кодирующие соответственно четыре формы PMCA 1, 2, 3 и , экспрессирующиеся в различных тканях млекопитающих. Молекулярная масса Ca2+-АТРазы плазматических мембран равна 138 кД.
Реконструированный в фосфолипидных везикулах фермент переносит один ион Ca2+ при гидролизе одной молекулы АТР. В отличие от АТРазы ЭР кальциевый насос плазмалеммы переносит Ca2+ в обмен на протоны в наиболее вероятной стехиометрии один к двум, т.е. по электронейтральному механизму. Помимо КМ, Ca2+-АТРаза плазмалеммы находится под контролем ряда других регуляторных факторов, действующих как с внутренней, так и с внешней стороны мембраны. В некоторых клетках показано, что Ca2+-АТРаза плазматической мембраны непосредственно регулируется гормонами через соответствующие рецепторы. Так, окситоцин ингибирует Ca2+-АТРазу мембраны миометрия , а инсулин - АТРазу адипоцитов .
