CRISPR Система: механизм действия, интерференция
Специфическое разрезание молекулы-мишени in vivo под действием крРНК показано лишь в случае S. thermophilus . При инфекции бактериофагом клеток, в CRISPR-кассетах которых присутствуют спейсеры , идентичные участкам геномной ДНК бактериофага, внутри последовательностей протоспейсеров накапливаются двуцепочечные разрывы [ Garneau J., et al., 2010 ]. Естественно, что такая инфекция оказывается непродуктивной. В этой же работе показано, что в клетках, содержавших геномную делецию гена cas9 (кодируемый им белок является, по-видимому, нуклеазой), расщепления ДНК фага не наблюдается и инфекция продуктивна.
У E. coli К12 не обнаружено спейсеров, соответствующих известным бактериофагам, а экспрессия cas-генов подавлена белком H-NS . Поэтому CRISPR/Cas-система этого организма оказывается неактивной. Чтобы проверить, способен ли Каскад E. coli К12 в комплексе с крРНК обеспечивать защиту от фаговой инфекции, созданы эскпрессионные плазмиды, несущие искусственные CRISPR-кассеты со спейсерами, идентичными различным фрагментам генов фага лямбда [ Brouns S.J., et al., 2008 ]. Индукция ко-экспрессии таких пре-крРНК и полного набора Cas-белков обеспечивает клеткам устойчивость к бактериофагу. Устойчивость не возникает при отсутствии любого из компонентов Каскада или гена cas3 . Отсутствие генов cas1 и cas2 не влияет на возникновение устойчивости, что и послужило основанием для гипотезы о том, что продукты этих генов участвуют в адаптации . In vitro Каскад E. coli узнает чужеродную двуцепочечную ДНК. Образующийся при этом комплекс содержит участок локально расплавленной ДНК, образующий РНК-ДНК-гетеродуплекс длиной 33 п.н. Для образования гибрида крРНК-ДНК расходования ATP не требуется. Для эффективного узнавания мишени эффекторным комплексом необходима PAM -последовательность (предполагаемый консенсус для E. coli ATG/AAG) и полная комплементарность крРНК и первых семи нуклеотидов протоспейсера (так называемая seed-последовательность). Несовпадения по другим позициям допустимы и не препятствуют узнаванию мишени [ Semenova E., et al., 2011 ].
Как и другие иммунные системы, CRISPR-системы должны обладать способностью отличать "свою" и чужеродную ДНК. В противном случае эффекторный комплекс Каскада с крРНК мог бы связываться с участком CRISPR-кассеты , содержащим соответствующий спейсер, что могло бы приводить к деградации геномной ДНК. Марраффини и Сонтхаймер [ Marraffini L.A., Sontheimer E.J., 2010 ], изучавшие CRISPR-систему S. epidermidis RP62A, показали, что для деградации ДНК-мишени эффекторным комплексом необходимо, чтобы не возникали комплементарные взаимодействия между нуклеотидами крРНК и ДНК-мишени в позициях -2, -3, -4 (если за +1 принять первое основание протоспейсера ). По-видимому, комлементарные взаимодействия крРНК и ДНК-мишени по этим позициям нарушают образование эффекторного комплекса, что предотвращает разрезание геномной ДНК и ее последующую деградацию.
Хейл и соавт. [ Hale C., et al., 2009 ] изучали работу эффекторного комплекса P. furiosus in vitro. Оказалось, что мишенью действия этого комплекса является РНК, а не ДНК. Авторы добавляли меченые молекулы РНК-мишени к комплексу очищенных рекомбинантных " коровых " Cas-белков и крРНК, комплементарных меченым РНК. Молекулы РНК-мишеней распознаются и разрезаются напротив 14-го нуклеотида с 3'-конца крРНК, то есть 3'-конец крРНК выступает в роли "молекулярной линейки", измеряющей расстояние до разрыва. Участвует ли специфическая РНК-расщепляющая активность эффекторного комплекса P. furiosus в ограничении ГПГ или является артефактом реакции in vitro - не известно.
