CRISPR Система: механизм действия, адаптация
Первые доказательства существования процесса встраивания новых спейсеров в CRISPR кассеты , получены Баррангу и соавт. [ Barrangou R., et al., 2007 ] при изучении мутантов S. thermophilus , приобретших устойчивость к бактериофагу в ходе инфекции. Оказалось, что CRISPR-кассеты мутантных клеток удлиняются за счет встраивания новых спейсеров, идентичных фрагментам генома фага, к которому возникла устойчивость. Введение спейсера (и соответственно повтора) в CRISPR-кассету чувствительных клеток искусственным путем (генноинженерными методами) также приводит к возникновению устойчивости. Таким образом, наличие CRISPR-спейсера, идентичного фрагменту генома бактериофага, явилось достаточным условием для возникновения устойчивости к этому бактериофагу. Были отобраны также мутантные бактериофаги, которые заражают и чувствительные клетки дикого типа, и устойчивые клетки с удлиненной CRISPR-кассетой. Как оказалось, участок ДНК фага, соответствующий CRISPR-спейсеру устойчивой клетки (такой участок называется " протоспейсер "), содержит однонуклеотидные замены, нарушающие комплементарное соответствие протоспейсера и спейсера. Таким образом, некоторые точечные мутации в протоспейсере снимают защитное действие CRISPR-системы.
Новые спейсеры встраиваются в конец кассеты, примыкающий к лидерной последовательности [ Horwath P., et al., 2008 ]. Это указывает на то, что лидерная последовательность, скорее всего, активно участвует в адаптации. Безлидерные CRISPR-кассеты, по-видимому, не способны встраивать новые спейсеры [ Lillestol R.K. 2006 ]. Самые удаленные от лидера спейсеры, возможно, являются самыми древними. Таким образом, CRISPR-кассету можно рассматривать как своеобразную "историю болезни" штамма, в которой порядок следования спейсеров отражает хронологию взаимодействия с фагами/плазмидами. Однако, эта история не совершенна, так как рост кассеты ограничен, и многие внутренние спейсеры утрачиваются в результате делеций [ Andersson A.F., Banfield F., 2008 ] или рекомбинаций внутри кассеты.
В работах Дево и соавт. [ Horwath P., et al., 2008 , Deveau H., et al., 2008 , Mojica F.J., et al., 2009 ] показано, что к протоспейсерам, соответствующим спейсерам CRISPR-кассеты S. thermophilus, прилегает последовательность PAM (Protospaser Adjacent Motif - последовательность, прилегающая к протоспейсеру) - AGAAW . Как оказалось, мутантные фаги, имеющие точечные замены в этой последовательности, заражают даже те клетки, CRISPR-кассеты которых содержат спейсеры, в точности соответствующие протоспейсеру [ Horwath P., et al., 2008 , Deveau H., et al., 2008 ]. Очевидно, что PAM играют важную роль в функционировании CRISPR-кассет.
Белки Cas1 и Cas2 - единственные строго консервативные белки всех CRISPR-систем. В случае E. coli , наличие генов cas1 и cas2 не влияет на защитное действие CRISPR-системы; это служит основанием для гипотезы о том, что продукты этих генов участвуют в адаптации [ Brouns S.J., et al., 2008 ]. К сожалению, прямых экспериментальных данных, подтверждающих это предположение, не имеется ни для одной CRISPR-системы.
В составе Cas1 обнаружен предполагаемый интегразный домен [ Makarova K.S., et al., 2006 ]. Cas1 E. coli К12 способен расщеплять структуры Холлидея in vitro [ Babu M., et al., 2011 ]. Cas1 P. aeruginosa имеет ДНК-азную активность. В присутствии ионов марганца или магния этот белок способен расщеплять как одно-, так и двуцепочечную ДНК на фрагменты длиной около 80 п.н. [ Wiendenheft B., et al., 2009 ]. Cas1 из Sulfolobus solfataricus нуклеазной активностью не обладает, однако этот белок имеет сильное сродство к ДНК и РНК и способен ускорять гибридизацию ДНК и РНК [ Han D., Krauss G., 2009 ]. Возможно, Cas1 участвует в процессе встраивания новых спейсеров в CRISPR-кассету.
В геномах некоторых микроорганизмов гены cas1 и cas4 (csa1) слиты в один ген. Этот факт, вероятно, указывает на то, что продукты этих генов вовлечены в один и тот же процесс и работают согласовано [ van der Oost, J., et al., 2009 ]. Сas4, по-видимому, является RecB-подобной нуклеазой [ Makarova K.S., et al., 2006 ].
Данные о кристаллической структуре и биохимических свойствах Cas2 из S. solfataricus получены Белоглазовой и соавт. [ Beloglazova N., et al., 2008 ]. Cas2 оказался металлозависимой рибонуклеазой, предпочтительно разрезающей одноцепочечные молекулы РНК в районах, обогащенных остатками уридина [ Beloglazova N., et al., 2008 ]. В клетках E. coli Cas2 накапливается в районах клеточных полюсов [ Tang J., et al., 2010 ], которые считаются самыми уязвимыми для проникновения фагов частями клетки [ Edgar R., et al., 2008 ].
При изучении S. thermophilus показано, что клетки, в геноме которых отсутствует ген cas7 , не способны встраивать новые спейсеры. Однако непонятно, является ли Сas7 единственным белком, задействованным в этом процессе у этого организма, или же он действует в комплексе с другими клеточными белками. [ Garneau J., et al., 2010 ].
