CRISPR Система: основные сведения
CRISPR-Cas система (от clustered regularly interspaced short palindromic repeats, короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) - это система адаптивного иммунитета прокариот, которая обеспечивает защиту клетки от чужеродных генетических элементов. В состав CRISPR-Cas системы входят CRISPR кассета , состоящая из коротких идентичных фрагментов ДНК (повторов), разделенных короткими уникальными участками ДНК ( спейсерами ), и cas (от CRISPR-associated) гены [ 32 ]. В общем виде, механизм защитного действия CRISPR-Cas систем представлен на Рис. 3 . CRISPR кассета транскрибируется, как единый РНК предшественник (пре-крРНК), который затем процессируется с образованием набора коротких фрагментов РНК ( крРНК ).
Системы CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) прокариот обнаружены в геномах многих эубактерий и подавляющего большинства архей . Уникальная особенность этих систем заключается в том, что они способны обеспечивать адаптивный наследуемый иммунитет к мобильным генетическим элементам .
Значительная часть геномов эубактерий и архей представлена генами, приобретенными в ходе горизонтального переноса генов (ГПГ) [ Nakamura Y., et al., 2014 ]. Основные механизмы, обеспечивающие ГПГ, - это поглощение ДНК из внешней среды ( трансформация ) и перенос чужеродного генетического материала мобильными генетическими элементами, такими как плазмиды ( коньъюгация ) или бактериофаги ( трансдукция ) [ Thomas C.M., et al., 2005 ]. Встраивание чужеродной ДНК может приводить к нарушению функций клеточных генов [ Jore M M., et al., 2010 , Coleman D., et al., 1991 ], поэтому у прокариот имеются механизмы, которые ограничивают ГПГ, предотвращая проникновение чужеродной ДНК в клетку или разрушая чужеродную ДНК внутри клетки. Один из таких механизмов обеспечивается системой рестрикции - модификации . Ферменты модификации метилируют рестрикционные сайты в геноме бактерий, предотвращая их разрезание нуклеазами рестрикции. Чужеродная ДНК, содержащая неметилированные сайты рестрикции, расщепляется под действием клеточных нуклеаз. В качестве другого механизма, предотвращающего ГПГ, можно рассматривать появление мутаций в генах, кодирующих поверхностные рецепторы, используемые бактериофагами для проникновения в клетку. В результате фаг перестает адсорбироваться на поверхности бактерий [ Rocha E.P.C., et al., 2001 ]. Известны также разнообразные, но мало изученные внутриклеточные механизмы абортивной инфекции, которые активируют гибель зараженной клетки и тем самым препятствуют распространению фагов и плазмид в популяции [ Jore M M., et al., 2010 ].
Открыт еще один механизм защиты прокариот от бактериофагов и плазмид, осуществляемый системами CRISPR. Самым неожиданным свойством возникновения устойчивости к мобильным генетическим элементам под действием CRISPR-систем оказалось то, что клетка становится защищенной лишь после проникновения чужеродной ДНК. При этом приобретенная защита наследуема в поколениях. Таким образом, в определенном смысле CRISPR- системы являются примером классической адаптивной эволюции по Ламарку (наследуемость благоприобретенных признаков).
Так называемая CRISPR-кассета представляет собой набор коротких несовершенных палиндромных повторов ДНК, разделенных спейсерами - участками ДНК одинаковой длины, но различающимися по последовательности, которые внутри одной кассеты практически идентичны ( рис. 1 ). CRISPR- кассете предшествует обогащенная AT лидерная последовательность , длина которой обычно составляет несколько сот пар нуклеотидов [ Jansen R., et al., 2002 ]. В непосредственной близости от большинства CRISPR-кассет находятся cas-гены (CRISPR-associated - ассоциированные с CRISPR). Cas-белки (некоторые из них являются хеликазами и нуклеазами ) обеспечивают функционирование CRISPR-систем [ Haft D.H., et al., 2005 ].
В 2005 г. три группы ученых независимо друг от друга обнаружили, что последовательности многих CRISPR-спейсеров сходны с участками геномной ДНК бактериофагов и плазмид [ Bolotin A., et al., 2005 , Mojica F.J., et al., 2005 , Pourcel C., et al., 2005 ]. Предположили, что такие спейсеры могли бы обеспечивать соответственно устойчивость клеток к заражению бактериофагами и предотвращать трансформацию плазмидами. Это предположение подтверждено экспериментально: в 2007 г. Баррангу (Barrangou) и соавт. [ Barrangou R., et al., 2007 ] показали, что клетки Streptococcus thermophilus , несущие в CRISPR-кассете спейсер, идентичный участку геномной ДНК бактериофага, становятся устойчивыми к этому фагу.
В общем виде, механизм защитного действия CRISPR-систем сводится к следующему. CRISPR-кассета транскрибируется как единый протяженный предшественник ( пре-крРНК ), который процессируется с образованием набора коротких фрагментов ( крРНК ), каждый из которых содержит последовательность одного из спейсеров CRISPR-кассеты. крРНК в комплексе с Cas-белками связывается с комплементарной чужеродной ДНК или РНК, что приводит к ее расщеплению ( рис. 2 ).
