Мутагенез у цианобактерий: рекомбинация
Определенные гены могут быть мутагенизированы с помощью гомологичной рекомбинации для того, чтобы наблюдать либо эффект инактивации данного гена, либо эффект небольших изменений в нуклеотидной последовательности ДНК данного гена [ Golden J.W., Wiest D.R. 1988 , Williams J.G., Szalay A.A. 1983 ]. Гомологичная рекомбинация в результате одиночного кроссовера внутри гена инактивирует ген только в том случае, если рекомбинирующий фрагмент не содержит ни начала, ни конца транскрипционной единицы. Для получения мутации с более протяженным фрагментом требуется реципрокная двойная рекомбинация [ Golden S.S. 1988 , Golden S.S., et al. 1986 , Golden S.S., et al. 1987 , Williams J.G., Szalay A.A. 1983 ]. Этот подход позволил охарактеризовать функции многих цианобактериальных генов [ Галкин А.Н. и др. 2000 , Bhalerao R.P., et al. 1994 , Boison G., et al. 1998 , Chitnis P.R., et al. 1989 , Ghassemian M., Straus N.A. 1996 , Ivleva N.B., et al. 2000 , Koksharova O., et al. 1998 , Marin K., et al. 1998 , Nyhus K.J., et al. 1993 , Pakrasi H.B., et al. 1988 , Yoshihara S., et al. 2000 ].
Поскольку фенотип транспозонного мутанта может быть результатом комбинированного эффекта спонтанной мутации где-нибудь в геноме и устойчивости к антибиотику, привнесенной транспозоном, обычно реконструируют такие мутанты с помощью гомологичной рекомбинации, чтобы проверить, действительно ли обусловлен мутантный фенотип только инсерцией транспозона в данный ген.
Двойная рекомбинация в одних штаммах цианобактерий происходит чаще, в других - реже. Одним из успешных способов селекции двойных рекомбинантов, например, в Anabaena 7120 может послужить использование гена sacB [ Black T.A., et al. 1993 , Cai Y., Wolk C.P. 1990 ].
Присутствие гена sacB при высокой концентрации сахарозы в твердой среде летально для клеток. Введение мутантного аллеля в результате одиночного кроссинговера и затем использование sacB для селекции одной из двух полученных копий вводимого аллеля, позволяет заменить аллель дикого типа мутантным аллелем без введения в клетку гена устойчивости к антибиотику [ Andersson C.R. et al. 2000 ]. Такой подход может оказаться очень удобным, если, например, нужно получить штамм, который будет активно использоваться (например, если нужно инактивировать ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции), а ген, определяющий устойчивость к антибиотику, может быть включен в будущие плазмидные векторы, которые будут работать в данном штамме. Целые гены могут быть делетированы, и рекомбинантные формы исходного гена затем могут быть введены в клетку для изучения, например, влияния одиночных или множественных аминокислотных замен на функцию белка, кодируемого данным геном [ Boerner R.J., et al. 1992 , Debus R.J., et al. 1988 , Ermakova-Gerdes S., Vermaas W. 1999 , Ermakova-Gerdes S., et al. 2001 , Rosenberg C., et al. 1999 , Tichy M., Vermaas W. 1999 , Vermaas W.F.J., et al. 1990 ].
Анализ псевдоревертантов, в которых супрессорная мутация картируется в локусе, отличном от локуса, в котором произошла первичная мутация, может помочь идентифицировать гены, чьи продукты взаимодействуют с белком, затронутым первичной мутацией [ Kufryk G.I., Vermaas W.F.J. 2001 , Tichy M., Vermaas W. 2000 ]. Кроме того, описан метод, основанный на использовании ПЦР для локального изменения гена и для создания генных сшивок в Synechocystis [ Taroncher-Oldenburg G., Stephanopoulos G. 2000 ]. Ранее способы мутагенеза для Synecocystis были подробно рассмотрены в обзорах Vermaas [ Vermaas W.F.J. 1996 , Vermaas W.F.J. 1998 ].
