Цианобактерии: плазмидные векторы и генетические маркеры
Плазмидные векторы можно подразделить на те, которые могут реплицироваться в выбранной клетке-хозяине (репликативные векторы), и на те, которые не способны к такой репликации. Каждый из этих двух типов векторов может найти свое экспериментальное применение. Репликативные векторы могут быть использованы для экспрессии чужеродного гена в новом хозяине. Такие векторы могут иметь широкий круг хозяев. Производные плазмиды RSF1010 , например, способны реплицироваться в Synechocystis [ Marraccini P., et al. 1993 , Mermet-Bouvier P., et al. 1993 ], как и в Anabaena 7120 [ Thiel T. 1994 ], Synechococcus (включая термофильный штамм) и в Pseudanabaena [ Muhlenhoff U., Chauvat F. 1996 , Sode K., et al. 1992 ] и могут быть рекомендованы для проверки на способность к репликации в новых штаммах, только вводимых в генетический эксперимент.
Плазмидные векторы, которые могут быть перенесены в клетку нового хозяина, но не могут в ней реплицироваться, являются идеальным инструментом для переноса ДНК. Эта ДНК может быть использована для транспозонного мутагенеза, если несет транспозон в своем составе, или для интеграции в хромосому (в результате гомологичной рекомбинации) с тем, чтобы стабильно поддерживаться в таком состоянии.
Разнообразные плазмидные векторы для цианобактерий описаны в обзоре Терезы Тиль [ Thiel T. 1994 ].
Клетки, которые содержат трансформирующую ДНК, обычно идентифицируют с помощью переноса в эти клетки гена, чей белковый продукт способен инактивировать антиметаболит, например, антибиотик. Когда проводят выращивание бактерий в присутствии антибиотика, только клетки, в которые перенесен соответствующий ген, могут расти. При работе с таким маркером в начале эксперимента необходимо определить концентрации данного антибиотика, превышение которых предотвращает рост нового хозяина. Поскольку цианобактерии структурно относятся к грамотрицательным бактериям, для них часто используют антибиотики и гены устойчивости к антибиотикам, которые эффективны для этой группы бактерий. Среди таких антибиотиков неомицин и канамицин и соответствующие гены, кодирующие неомицин фосфотрансферазу ( npt ген ) из транспозонов Tn5 и Tn903 , а также стрептомицин и спектиномицин и соответствующие гены, кодирующие аминогликозидаденилтрансферазу ( aadA ген ) из транспозона Tn7 [ Wolk C.P., et al. 1993 ] и из омега интерпозона [ Prentki P., et al. 1991 ]. Хлорамфеникол и ген, кодирующий хлорамфениколацетил трансферазу ( cat ген ), успешно используются для экспериментов с одноклеточными цианобактериями [ Chauvat F., et al. 1986 , Golden S.S., Sherman L.A. 1983 ] и с нитчатой цианобактерией Anabaena sp. штамм 90 [ Rouhiainen L., et al. 2000 ]. Такие антибиотики, как тетрациклин и рифампицин , являясь светочувствительными, реже используются для цианобактерий. Их можно использовать только в том случае, если поставить фильтр, отсекающий длины волн, к которым чувствительны эти антибиотики.
Поскольку ампициллин-деградирующий фермент бета-лактамаза секретируется клетками, клетки донорного штамма, несущего соответствующий ген и участвующего в коньюгации, могут защищать клетки реципиентного штамма, даже если ген не был перенесен. Поэтому плазмида, кодирующая бета-лактамазу, может быть использована для получения трансформантов или для подтверждения коньюгационного переноса, но не совсем удобна для первичной селекции эксконьюгантов. Сконструировано несколько удобных кассет, несущих гены устойчивости к антибиотикам [ Elhai J., Wolk C.P. 1988 ].
Из антибиотиков, которые обычно используются для грамположительных бактерий, для цианобактерий успешно применяется эритромицин [ Grigorieva G., Shestakov S. 1982 , Shen G., et al. 1993 , Shestakov S.V., Khyen N.T. 1970 , Wolk C.P., et al. 1984 ]. Среди других антибиотиков, используемых обычно для грампозитивных бактерий, представляют интерес для эффективной работы с цианобактериями тиострептон , гигромицин [ Ohkawa H., et al. 2000 ], пиромицин и апрамицин .
Некоторые антиметаболиты, действующие на фотосинтез, использовались для селекции устойчивых к ним цианобактериальных мутантов [ Кокшарова О.А., Шестаков С.В. 1990 , Полухина Л.Е. и др. 1982 , Ajlani G. et al. 1989 , Bartsevich V.V., Shestakov S.V. 1995 , Elanskaya I.V., et al. 1998 , Golden S.S., Sherman L.A. 1984 , Narusaka Y., et al. 1998 ]. Среди них атразин или 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина (DCMU) , которая блокирует электронный транспорт от фотосистемы 2 ; метронидазол , который взаимодействует с электронным транспортом от фотосистемы 1 ; нитрофенольные гербициды. Однако гены, которые определяют устойчивость к этим ингибиторам фотосинтеза, не часто применялись в качестве маркеров для генетического переноса.
Для селекции был использован габакулин , который ингибирует синтез дельта-аминолевулиновой кислоты, и, следовательно, хлорофилла, и ген, который обеспечивает устойчивость к габакулину [ Allison G., et al. 1997 ]. Сходным образом для селекции могут быть использованы гербициды, приводящие к выцветанию [ Hirschberg J., Chamovitz D. 1994 ], такие как норфлуразон [ Martinez-Ferez I.M., Vioque A. 1992 ], ингибирующий синтез каротеноидов.
Иногда бывает удобно использовать в качестве маркера ген, который кодирует люциферазу [ Engebrecht J., et al. 1983 , Foran D.R., Brown W.M. 1988 ] или зеленый флуоресцирующий белок ( GFP ) [ Crameri A., et al. 1996 ]. Люминесценция или флуоресценция позволяют легко и с высокой чувствительностью обнаружить факт осуществления генетического переноса в клетку реципиента [ Billi D., et al. 2001 , Murry M.A., Wolk C.P. 1991 , Schmetterer G., et al. 1986 ].
