Цианобактерии: экспрессия генов
Знание нуклеотидных последовательностей всего генома обеспечивает возможность наблюдения за глобальными изменениями в генной экспрессии на уровнях транскрипции и трансляции в ответ на различные изменения условий окружающей среды. Методы, используемые для исследования глобальной экспрессии генов эукариот [ Gupta R., et al. 1998 , Schena M., et al. 1995 , Zhao N., et al. 1995 ] менее пригодны для работы с прокариотами, поскольку в случае прокариот нельзя использовать poly(A) [ Aviv H., Leder P. 1972 ] для отделения бактериальной мРНК от рРНК. При гибридизации кДНК, полученной на основе тотальной РНК прокариот, значительный вклад в фон вносит именно большое количество рРНК, что понижает чувствительность метода. Несмотря на успех, достигнутый в работе с E. coli [ Richmond C.S., et al. 1999 ], в случае цианобактерий без удаления рРНК трудно достичь повышения чувствительности метода. Сложно уменьшить количество рРНК без одновременного уменьшения популяции мРНК.
Одним из методов селективного уменьшения пула рРНК может быть процедура, разработанная фирмой Affymetrix: праймеры, специфичные к 23S и 16S рРНК гибридизуются с такими же рРНК, а затем используют обратную транскрипцию для образования первой цепи кДНК для рРНК, что приводит к образованию рРНК/кДНК гибрида. Потом для деградации РНК в таких РНК/ДНК гибридах применяют специфичный фермент РНКазу Н [ Nicholson A.W. 1997 ]. После этого образцы обрабатывают ДНКазой I, свободной от РНКаз, для разрушения оставшейся кДНК цепи рРНК. Ни один из этих этапов не затрагивает мРНК.
Другой подход заключается в захвате обратно транскрибированной кДНК из общего пула РНК путем связывания с таким количеством биотинилированной геномной ДНК, какое будет достаточно для связывания с большинством кДНК, соответствующих мРНК, и только с малой фракцией кДНК, синтезированных на рРНК [ Graham J.E., Clark-Curtiss J.E. 1999 ].
Существует и третья возможность, которая была применена для изучения Synechocystis [ Singh A.K., Sherman L.A. 2000 ]. Этот подход заключается в амплификации с помощью ПЦР всех не рРНК генов (создается так называемая " customized amplification library", или CAL ), затем проводится насыщение меченной биотином кДНК с CAL, задержка таких комплексов на стрептовидиновых шариках, отмывка этих шариков, элюция и мечение оставшейся связавшейся с шариками библиотеки CAL, которую используют в качестве зондов в экспериментах с ДНК эррей [ Alland D. et al. 1998 ].
"Differential display" - метод, основанный на обратной транскрипции и сопряженной с ней ПЦР, позволяет проводить быстрый скрининг генов, которые экспрессируются в специфических условиях. Этот метод был использован, например, в работе по идентификации генов, регулируемых интенсивностью света в цианобактерии Synechocystis [ Bhaya D., et al. 2000b ].
