ДНК-полимераза дельта: функции
В отсутствие PCNA ДНК-полимераза дельта имеет низкую процессивность на длинных однонитевых матрицах, однако в присутствии PCNA процессивность возрастает в 10-100 раз. С помощью делеционных мутантов установлено, что в ДНК-полимеразе дельта из клеток мыши за связывание PCNA ответствен участок 129-149 из первых 182 аминокислотных остатков N-концевой области каталитического полипептида, С-концевой домен менее консервативен и содержит два участка связывания ДНК [ Zhang S.-J. et al., 1995 ].
Холофермент ДНК-полимеразы дельта включает в себя фактор процессивности PCNA и факторы RF-C и RP-A , он собирается на праймер-матричном комплексе в следующем порядке [ Baker Т.А., Bell S.P., 1998 , Tsurimoto Т. et al., 1990 , Tsurimoto T., Stillman B., 1991 , Burgers M., 1991 , Podust V.N. et al., 1992 , Sexton D.J. et al., 1997 ]: сначала RF-C связывается с 3'-ОН-концом затравки на однонитевой ДНК- матрице, "покрытой" белком RP-A, затем RF-C в присутствии АТР формирует на ДНК-дуплексе, прилежащем к 3'-концу затравки, кольцевую структуру из трех молекул PCNA с мол. массой 36 кДа, которая обеспечивает присоединение ДНК-полимеразы дельта к 3'-концу затравки, завершая таким образом формирование высокопроцессивного холофермента.
RF-C представляет собой гетеропентамер, состоящий из субъединиц 140-145, 40, 38, 37 и 36 кДа, он обладает АТРазной активностью, стимулируемой ДНК и PCNA. Все пять субъединиц этого фактора содержат в С-концевой области консервативные PCNA-связывающие участки [ Fotedar R. et al., 1996 ], а в самом PCNA идентифицированы участки, отвечающие за связывание с субъединицами RF-C и ДНК-полимеразами [ Eissenberg J.C. et al., 1997 , Mossi R. et al., 1997 , Zhang P. et al., 1998 ].
В присоединении к ДНК-полимеразе дельта участвуют аминокислотные остатки 121-135, образующие петлю между доменами PCNA [ Eissenberg J.C. et al., 1997 , Zhang P. et al., 1998 , Jonsson Z.O. et al., 1998 ]. Три молекулы PCNA образуют кольцевой тример с отверстием для двунитевой ДНК в центральной части, который представляет собой перемещающуюся по ДНК подвижную платформу или "скользящую скрепку" ("sliding clamp") в форме тора (бублика), удерживающую ДНК-полимеразу дельта в ходе полимеризации на матрице и обеспечивающую высокопроцессивный синтез ДНК [ Cox L.S., 1997 , Schurtenberger P. et al., 1998 ].
Хотя PCNA и прокариотический фактор процессивности - субъединица (бета ДНК-полимеразы III Е. coli - имеют низкую гомологию на уровне первичной структуры, оба белка формируют близкие по пространственной геометрии структуры "скользящей скрепки" [ Krishna T.S. et al., 1994 ]. Репликативный белок RP-A является гетеротримером (субъединицы 70, 32-34 и 11-14 кДа) и представляет собой ядерный белок, связывающий однонитевую ДНК (SSB). Он обеспечивает оптимальную для синтеза ДНК конформацию матрицы, хотя при этом возможно прямое взаимодействие отдельных субъединиц RP-A с ДНК-полимеразами.
В ходе клеточного цикла меняется уровень фосфорилирования RP-A, которое носит регуляторный характер. При этом регуляторным доменом является N-концевой фрагмент субъединицы 32 кДа, в котором находятся участки фосфорилирования RP-A. При повреждающих воздействиях на клетку, типа УФ-облучения, происходит гиперфосфорилирование субъединицы 32-34 кДа RP-A, которое коррелирует с подавлением репликации ДНК.
PCNA стабилизирует комплекс ДНК-полимеразы дельта с праймер- матрицей, предотвращает преждевременную диссоциацию фермента и тем самым обеспечивает высокую процессивность синтеза. Однако при этом PCNA способствует фиксации в новообразованной ДНК ошибочно включенных природных и модифицированных нуклеотидов [ Mozzherin D.J. et al., 1997 ]. Фосфорилирование PCNA-связывающего домена RF-C , вероятно, является способом регуляции PCNA-зависимого синтеза ДНК, осуществляемого ДНК- полимеразой дельта (и эпсилон ). Показано, что фосфорилирование PCNA- связывающего домена RF-C Са2-кальмодулин-зависимой протеинкиназой II ( СаМКII ) ингибирует связывание PCNA с RF-C и, как следствие, подавляет PCNA-зависимый синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами дельта и эпсилон [ Maga G. et al., 1997 ].
С другой стороны, RF-C в комплексе с PCNA и ДНК недоступен для фосфорилирования СаМКII.
По другим данным, фосфорилирование PCNA-связывающего домена в большой субъединице (145 кДа) RF-C, блокирующее связывание PCNA, может осуществляться при участии циклин-зависимых протеинкиназ, регулирующих клеточный цикл [ Fotedar A. et al., 1996 ].
3'-5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы дельта также регулируется факторами, входящими в состав холофермента [ Lee S.H., 1993 ]. В отсутствие вспомогательных факторов 3'-5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы дельта низка, однако в присутствии белка RP-A она возрастает в 8-10 раз. Активирующий эффект RP-A на 3'-5'-экзонуклеазную активность обусловлен, очевидно, дестабилизацией комплекса затравки с матрицей в присутствии этого SSB-белка. При этом действие RP-A на 3'-5'- экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы дельта человека является видоспецифичным и проявляется только в присутствии RP-A человека, хотя стимулирующий эффект RP-A на полимеразную активность фермента не зависит от источника RP-A. RF-C и PCNA ни по отдельности, ни совместно не влияют на 3'-5'-экзонуклеазную активность фермента, однако они снимают стимулирующий эффект RP-A на эту активность.
Зависимость эксцизионной репарации от PCNA указывает на участие ДНК-полимеразы дельта (и/или ДНК-полимеразы эпсилон) в репаративном синтезе ДНК [ Shivji M.K.K. et al., 1992 , Aboussekhra A. et al., 1995 , Budd M.E., Campbell J.L., 1995 , Shivji M.K.K. et al., 1995 ]. В соответствии с этим антитела к ДНК-полимеразе дельта специфически ингибируют репаративный синтез в клеточных экстрактах [ Zeng X.R. et al., 1994 ].
