ДНК-полимераза эукариот: функции
ДНК-зависимые ДНК-полимеразы осуществляют элонгацию затравок (праймеров) по схеме:
(PdN)n + dNTP = (PdN)n+1 + PPi (реакция обратима)
Матрицей для синтеза является ДНК, а в качестве затравки может использоваться фрагмент ДНК или РНК. Помимо нуклеотидилтрансферазного каталитического центра, осуществляющего полимеризацию в направлении от 5'к 3', в ДНК-полимеразах эукариот для удаления ошибочно включенных нуклеотидных остатков может присутствовать экзонуклеазный центр в направлении от 3'к 5', который выполняет корректорскую функцию при синтезе, а также дезоксирибофосфатлиазный центр (dRp-лиазный или АР-лиазный), вырезающий 5'-концевые апуриновые/апиримидиновые остатки (АР-сайты) в ходе репарации ДНК.
Точная пространственная структура, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа, известна лишь для одной ДНК-полимеразы эукариот - полимеразы бета-типа , которая заметно отличается по строению от других ДНК-полимераз эукариот. Однако наличие в первичной структуре ДНК-полимераз эукариот консервативных мотивов, гомологичных соответствующим мотивам прокариотических ферментов, указывает на то, что все ДНК-синтезирующие ферменты имеют общий план строения [ Joyce C.M., Steitz Т.А., 1994 , Joyce C.M., Steitz Т.А., 1995 , Sousa R., 1996 , Wang J. et al., 1997 ].
По форме ДНК-полимеразы можно уподобить полураскрытой кисти правой руки, в которой ладонь, большой палец и остальные пальцы представляют три основных пространственных домена и формируют полость, удерживающую ДНК-матрицу и затравку в ходе синтеза. Консервативные мотивы A, В и С образуют активный центр в домене "ладони", "пальцы" удерживают однонитевую матрицу, а "большой палец" "прижимает" праймер-матричный двунитевой участок. Рентгеноструктурный анализ позволит детализировать и, возможно, модифицировать эту модель применительно к различным типам ДНК-полимераз эукариот.
Согласно генетическому анализу три ДНК-полимеразы, а именно альфа , бета и эпсилон , абсолютно необходимы для размножения клеток дрожжей [ Boulet A. et al., 1989 , Morrison A., et al., 1990 ], что указывает на участие этих ферментов в репликации ядерного генома. При этом ДНК-полимераза альфа инициирует репликацию лидирующей нити ДНК в участке ori и синтезирует затравки фрагментов Оказаки запаздывающей нити, а ДНК-полимеразы дельта и эпсилон осуществляют элонгацию лидирующей и запаздывающей нитей [ Sugino А., 1995 ].
Аналогичная функция приписывается ДНК-полимеразам альфа , дельта и эпсилон в клетках высших эукариот. Сведения о строении репликативного ансамбля у высших эукариот получены преимущественно при изучении репликации вируса SV40 в бесклеточной системе с очищенными репликативными факторами [ Brush G.S., et al., 1995 , Bambara R.A. et al., 1997 ].
Репликация плазмидной ДНК с ori вируса в этой системе зависит от одного вирусного продукта (большого Т-антигена) и репликативных факторов эукариотической клетки. Убедительно показано, что ДНК-полимераза альфа осуществляет инициацию репликации лидирующей нити в районе ori SV40 и синтезирует затравки фрагментов Оказаки запаздывающей нити, а ДНК-полимераза дельта осуществляет процессивную элонгацию затравок, синтезированных ДНК-полимеразой альфа. Репликация плазмидной ДНК в бесклеточной системе происходит без участия ДНК-полимеразы эпсилон , хотя эксперименты по химической сшивке компонентов репликативного ансамбля указывают на участие ДНК-полимеразы эпсилон в репликации хромосомной ДНК [ Zlotkin Т. et al., 1996 ].
С помощью мутационного анализа показано, что синтез ДНК при эксцизионной репарации основания, первым этапом которой является удаление основания специфичной N-гликозилазой, осуществляется ДНК-полимеразой бета [ Sobol R.W. et al., 1996 ]. Экстракты клеток, гомозиготных по делеции гена ДНК-полимеразы бета, не способны репарировать остатки урацила в ДНК. Эти клетки обладают также повышенной чувствительностью к монофункциональным алкилирующим агентам, но не отличаются от контрольных клеток по чувствительности к УФ- и гамма-облучению, пероксиду водорода и цис-платине. Существует альтернативный механизм эксцизионной репарации оснований и нуклеотидов с участием ДНК-полимеразы дельта и/или ДНК-полимеразы эпсилон, о чем свидетельствует зависимость репарации от ядерного антигена пролиферирующих клеток ( PCNA ) - вспомогательного фактора этих ферментов [ Shivji M.K.K. et al., 1992 , Budd M.E., Campbell J.L., 1995 , Shivji M.K.K. et al., 1995 ]. По всей видимости, в ходе репарации ДНК-полимераза бета осуществляет преимущественно ресинтез на мононуклеотидных брешах ("short-patch repair"), тогда как ДНК-полимеразы дельта и эпсилон специализируются в ресинтезе на более протяженных брешах ("long-patch repair") [ Klungland A., Lindahl T., 1997 ]. Сведения об участии ДНК-полимеразы альфа в процессах репарации ДНК отсутствуют, однако имеется много данных о том, что этот фермент соочищается от 5'к 3'-, от 3'к 5'-экзонуклеазами и эндонуклеазами, что в принципе не исключает возможности его участия в репаративном синтезе на отдельных этапах развития. ДНК-полимераза гамма локализована в митохондриях , функция этого фермента связана с репликацией и репарацией мтДНК. Функция ДНК-полимеразы дзета изучена недостаточно, но есть основания предполагать участие этого фермента в мутагенезе ядерной ДНК.
