Изменения в структуре ДНК на стадии инициации транскрипции у бактерий
Для понимания роли изгибов ДНК в промоторной активности, следует напомнить о том, что инициация - это многоэтапный процесс, результатом которого является выплавление короткой области ДНК, окружающей сайт инициации, и синтез коротких олигонуклеотидов. Существующий взгляд на кинетику инициации может быть выражен в простой схеме ( Chamberlin, 1974 , McClure, 1980 ): начальное связывание фермента с промотором с образованием неактивного промежуточного закрытого комплекса (Kb), изомеризация этого комплекса в активный открытый комплекс, в котором обе нити ДНК примерно размером в 10 пар расплавлены вокруг сайта инициации транскрипции ( Рис.3 ).
Однако есть данные ( Kovacic, 1987 ; Mecsas et al, 1991 ; Schicor et al, 1990 ) о том, схема несколько более сложная. Первоначально РНК-полимераза заякоривается за промоторный "-35" бокс с образованием первого закрытого промоторного комплекса. Эти комплексы дают четкую картину защиты сахаро-фосфатного остова от гидроксил- радикального расщепления в диапазоне от "-60 нп" до "-1 нп" по отношению к стартовой точке. Двойная нить ДНК защищена ферментом только с одной стороны, в том числе в районе "-35 нп" промоторной зоны со стороны широкой бороздки. Именно в районе "-35 нп" детали этого взаимодействия по аналогии с другими белковыми комплексами наводят на мысль о вовлечении белкого мотива спираль-виток-спираль в контакт с этим боксом.
Продление (последующий этап) контакта приводит к образованию второго закрытого комплекса, при котором фермент взаимодействует более плотно с "-10 нп" боксом, и защищает от атак уже обе нити, начиная с "-10 нп" бокса и до "+24 нп". В области "-10 нп" имеет место уже нуклеотид-специфичный контакт. При этом проявляется модификация общей поверхности фермент-ДНК, особенно в промежутке между "-35" и "-10" боксами, где возникают чувствительные к обработке участки, ранее бывшие защищенными. Имеется несколько косвенных данных ( Mecsas et al, 1991 ; Auble & deHaseth, 1988 ; Amouyal & Buc, 1987 ), свидетельствующих о том, что одновременно хотя бы частично выравниваются гексамеры "-35" и "-10" на одной стороне ДНК, вызывая дополнительное напряжение в промежуточной последовательности. Предполагают, что это напряжение играет существенную роль в процессе образования открытого комплекса ( Ansari et al, 1992 ; Ayers et al, 1989 ), ибо внесение однонитевого разрыва и удаление 1 нуклеотида из одной нити, вызывая увеличение гибкости спейсера, приводит к замедлению перехода в открытый комплекс в случае оптимальной для инициации длины спейсера в 17 нп ( Ayers et al, 1989 ). Наличие напряжения, а вовсе не гибкость спейсора, трактуется как фактор, способствующий переходу в открытый комплекс. Сходные данные получены для сигма 70 и 32 субъединичных комплексов с РНК полимеразой и нескольких соответствующих субъединицам промоторов ( Spassky et al, 1985 ; Mecsas et al, 1991 ; Buc & McClure, 1985 ).
