Структурные основы взаимодействия CRP белка с ДНК
Связываясь со своими специфическими последовательностями, CRP. цAMP комплекс вносит резкий изгиб в ДНК ( Wu & Crothers,1984 ). Кристаллографические исследования CRP.цAMP -ДНК комплексов ( Schultz et al, 1991 ) указывают на то, что суммарный изгиб является результатом двух дискретных изгибов примерно на 45 град. каждый (на 40 град. в центральной TG паре каждой из TGTGA последовательностей и на 10о в А-тракте). Такое устройство соответствует общему изгибу области, по крайней мере, на 90 град. Связывание CRP белка с ДНК может упрочиться еще раз в 200, если sCRP находится в фазе с внутренне искривленным общим фрагментом ДНК, в состав которого он входит ( Kahn & Crothers, 1992 ). Оценки CRP-индуцированного изгиба ДНК, полученные с помощью электрофореза в геле, находятся в диапазоне 100 град.-130 град. ( Thompson & Landy, 1988 ).
Действительно ли кривизна ДНК, вызванная белком CRP, обепечивает активацию транскрипции соответствующих промоторов? sCRP участки могут быть заменены статично изогнутыми фрагментами ДНК при сохранении соотвествующей функции как в системе in vivo, так и in vitro ( Gartenberg & Crothers, 1991 ). Можно заменить функциональные sCRP сайты ДНК последовательностями, которые являются мишенями для гетерологичных ДНК-изгибающих белков (Pedersen et al, 1992). Однако встречатся CRP мутанты, которые в полной мере изгибают ДНК, но не способны активировать транскрипцию ( Bell et al 1990 ; Eschenlauer & Reznokoff, 1991 ; Zhou et al, 1993 ), что указывает на необходимость белок-белковых контактов. Более того, цAMP-CRP комплекс и сигма70-РНК-полимераза взаимодействуют в растворе ( Heyduk et al, 1993 ; Pinkey & Hoggtey, 1988 ) даже в отсутствии промоторной ДНК. Мутационный анализ CRP белка позволил индентифицировать область на поверхности белка, которая участвует в контактах с РНК-полимеразой, но удалена от ДНК связывающего домена ( Zhou et al, 1993 ). Известны также мутации в альфа субъединице РНК-полимеразы, приводящие к потере восприимчивости активации белком CRP на lac промоторе in vitro ( Igarashi & Ishihama, 1991 ; Ishihama 1992 ; Zou et al, 1992 ). Венцом всех этих исследований является вывод о том, что стимуляция CRP белком есть результат одновременного действия белок-индуцированных изгибов в ДНК и белок-белковых взаимодействий. Изгибание мишени может облегчить и стабилизировать контакты CRP-РНК-полимераза с образованием продуктивного нуклеопротеинового транскрипционного инициирующего комплекса. Степень изгибания ДНК, вызванного комбинацией CRP и РНК-полимеразой in vitro гораздо больше, чем то, что вызывается исключительно CRP белком и еще более усиливается при образовании открытого комплекса ( Zinkel & Crothers, 1991 ). Кроме белок-белковых взаимодействий, направляемых индуцированной кривизной ДНК, CRP индуцированный изгиб может стимулировать контакты верхней по отношению к промотору последовательности ДНК с тыльной частью поверхности РНК-полимеразы при переходе от закрытого в открытый комплекс.
Вспомним, максимальная активация получена, когда sCRP локализован в -61.5 и -41.5 нп вверх от точки старта транскрипции. Возможное объяснение этого в том, что CRP димеры имеют два активирующих домена и поэтому тот или иной продуктивно контактирует с РНК-полимеразой, связанной с промотором ( Gaston et al, 1990 ; Ushida & Aiba, 1990 ). Кроме того, CRP белок контактирует и с различными зонами РНК-полимеразы, когда локализован на -61.5 (cap промотор) или -41.5 нп (gal промотор), ( Igarashi & Ishihama, 1991 ; Ishihama, 1992 ). Эти два примера свидетельствуют еще и о разнице в механизмах активации, особенно заметной, когда речь идет о линейной матрице ДНК. В случае lac промотора, CRP усиливает связывание РНК-полимеразы, точнее образование закрытого комплекса ( Malan et al; 1984 ), тогда как на gal промоторе стимулирются как связывание, так и переход в открытый комплекс ( Herbert et al, 1986 ). Это объясняется тем, что связывание активатора с мишению как в случае с lac промотором, может только усилить связывание РНК-полимеразы с промотором в основном благодаря белок-белковым взаимодействиям. В случае gal промотора, в дополнении к этому эффекту, изгиб ДНК, вызванный CRP белком, также способствует контакту вышерасположенных последовательностей ДНК с тыловой строной РНК-полимеразы, приводя к образованию открытого комплекса по тому же механизму, как и в случае собственных изгибов ДНК. Такая стимуляция CRP белком в gal опероне зависит от присутствия коротких полиА трактов сразу же выше активаторного сайта ( Lavighne et al, 1992 ), который отсутствует в lac промоторе. Если этот А тракт удалить из gal оперона, то стимуляция CRP белком ограничивается только усилением сродства РНК-полимеразы к промотору ( Lavighne et al, 1992 ). Более того, изомеризация в открытый комплекс и на lac промоторе может происходить, если матрица ДНК в достаточной степени сверхспиралезована ( Mejklejohn & Gralla, 1989 ; Straney et al, 1989 ). То есть, недостатки топологии линейной ДНК можно компенсировать стимуляцией контактов РНК-полимеразы с вышерасположенной ДНК с целью усиления образования открытого комплекса. Резюмируя, можно сказать, что наличие изгибов в вышерасположенной по отношению к промотору ДНК определяет работу CRP белка, т.е. способность стимулировать образование открытого или закрытого комплекса.
Для какой стадии транскрипционного процесса имеет значение изгиб ДНК созданный CRP белком? Было выяснено ( Zinkel & Crothers, 1991 ), что изгиб сохраняется и даже увеличивается при образовании закрытого и открытого комплексов, помогая переходу в закрытый и открытый комплексы, но по некоторым данным запасенная в изгибе энергия может быть использована для противостояния сильным белок-белковым или ДНК-белковым взаимодейстиям, помогая тем самым полимеразе перейти к следующем стадиям транскрипции - инициации и элонгации и тем самым покинуть промотор. В пользу этого же свидельствуют данные по кинетике транскрипции на malT промоторе ( Memendez et al, 1987 ).
