Рестриктазы искусственные редкощепящие
Различные подходы к созданию искусственных
редкощепящих рестриктаз
Редкощепящие рестриктазы являются важным инструментом для манипулирования с геномными ДНК. В связи с актуальностью задачи секвенирования человеческого генома, в настоящее время широко обсуждаются различные подходы к созданию генетических карт длинных геномных ДНК. Общедоступное средство для специфического гидролиза длинных ДНК в достаточно редко расположенных сайтах сильно облегчило бы работу с такими молекулами.
Природные ферменты, эндонуклеазы рестрикции, как правило узнают сайты, состоящие из четырех - шести нуклеотидов. При гидролизе геномных ДНК такими ферментами получается огромное количество близких по длине фрагментов, слабо поддающихся разделению. Существуют эндонуклеазы рестрикции, узнающие 8- нуклеотидные сайты, но их мало, они узнают в основном CG-богатые последовательности, и их сайты, как правило, расположены кластерами. Статистически они встречаются один раз на 65,5 тыс.п.о., что также слишком часто. Эндонуклеазы, осуществляющие гидролиз в более редко расположенных сайтах, практически не встречаются ( Strobel S.A. and Dervan P.B., 1990 ). В связи с этим было предпринято несколько попыток создания искусственных систем, обеспечивающих такое расщепление ( Boidot-Forget M. ea, 1988 , Koob M. ea, 1988 , Strobel S.A. and Dervan P.B., 1990 , Strobel S.A. and Dervan P.B., 1991 , Strobel S.A. ea, 1988 , Francois J.C. ea, 1989a , Francois J.C. ea, 1989b , Praseuth D. ea, 1988a , Perroualt L. ea, 1990 , Lee B.K. ea, 1988 , Praseuth D. ea, 1988b , Koob M. and Szybalskii W., 1990 , Maher L.J. ea, 1989 , Hanvey J.C. ea, 1989 , Dervan P.B., 1992 , Francois J.C. ea, 1989c , Ferrin L.J. and Camerini-Otero R.D., 1991 ).
Существует два подхода к созданию искусственных редкощепящих рестриктаз. В первом подходе была использована способность олигонуклеотидов или их аналогов, усовершенствованных с точки зрения ДНК-связывающих свойств, состоящих из 10-12 нуклеотидов, специфично связываться с ДНК в достаточно редко расположенных сайтах ( Strobel S.A. and Dervan P.B., 1990 , Lee B.K. ea, 1988 , Boidot-Forget M. ea, 1988 , Strobel S.A. ea, 1988 , Francois J.C. ea, 1989a , Francois J.C. ea, 1989b , Praseuth D. ea, 1988a , Perroualt L. ea, 1990 , Praseuth D. ea, 1988b ). К олигонуклеотидам пришивалась активная группировка, способная гидролизовать ДНК в местах их связывания. В качестве таких группировок использовались хелатные соединения некоторых металлов (Fe-EDTA ( Moser H.E. and Dervan P.B., 1987 , Boidot-Forget M. ea, 1988 , Strobel S.A. ea, 1988 ), Cu-фенантролин ( Francois J.C. ea, 1989a , Francois J.C. ea, 1989b )). Кроме того, двунитевые разрывы ДНК могут осуществляться при помощи реакции образования фотосшивок, индуцируемой некоторыми соединениями, ковалентно связанными с олигонуклеотидами ( Le Doan T. ea, 1987 , Praseuth D. ea, 1988a , Perroualt L. ea, 1990 , Lee B.K. ea, 1988 , Praseuth D. ea, 1988b ). В качестве таких соединений могут выступать азидопроизводные (азидопрофлавин ( Le Doan T. ea, 1987 ), азидофенацил ( Praseuth D. ea, 1988a )); в этом случае фотосшивки преобразуются в двунитевые разрывы при обработке щелочью. В работе Perroualt L. ea, 1990 к 3'- концу олигонуклеотида пришивалась производная эллиптицина, способная непосредственно индуцировать двунитевые разрывы при облучении. Свободный эллиптицин также может вызывать двунитевые разрывы в области, пограничной с триплексом. Это происходит за счет его преимущественной интеркаляции в эту область.
Недостатки этого подхода заключались в невысоком выходе гидролизованной ДНК (в случае Fe-EDTA - 15-20% ( Moser H.E. and Dervan P.B., 1987 ), в случае Cu-фенантролина - выше - 70% ( Francois J.C. ea, 1989a )). Кроме того, наблюдалась недостаточная специфичность гидролиза ДНК, связанная с недостаточной специфичностью комплексов ДНК с олигонуклеотидами ( Strobel S.A. and Dervan P.B., 1990 ); в работе ( Francois J.C. ea, 1989a ) специфичность повышалась за счет повышения температуры реакции.
Другой подход основан на так называемом методе "Ахиллесовой пяты" ( Strobel S.A. and Dervan P.B., 1991 ). Схема этого метода показана на Рис. Схема метода "Ахиллесовой пяты" . ДНК в комплексе с ДНК-связывающим агентом (белком, олигонуклеотидом) обрабатывается метилазой . При этом сайты метилирования, перекрывающиеся с сайтами ДНК-связывающего агента, или примыкающие к ним, оказываются защищенными от метилирования. Затем производится инактивация метилазы и удаление ДНК- связывающего агента, после чего ДНК подвергается гидролизу с помощью эндонуклеазы рестрикции, имеющей соответствующий сайт узнавания. В результате ДНК оказывается гидролизованной только по тем сайтам рестрикции, которые остались непрометилированными, т.е., по сайтам, защищенным ДНК-связывающим агентом от метилазы ( Strobel S.A. and Dervan P.B., 1991 ).
Впервые метод был применен для lac и # лямбда-репрессоров, которые защищали от метилирования участки ДНК, находящиеся внутри сайтов их связывания ( Koob M. ea, 1988 ). Затем было показано, что не только белки ( Koob M. and Szybalskii W., 1990 ), Koob M. ea, 1988 ), но и образующие достаточно прочный триплекс олигонуклеотиды способны защищать от метилирования сайты, перекрывающиеся с сайтом их связывания ( Maher L.J. ea, 1989 , Strobel S.A. and Dervan P.B., 1991 , Hanvey J.C. ea, 1989 , Dervan P.B., 1992 , Francois J.C. ea, 1989c , Ferrin L.J. and Camerini-Otero R.D., 1991 ).
Использование олигонуклеотидов усовершенствовало метод "Ахиллесовой пяты", поскольку сайты их связывания могут быть короче и встречаться чаще, чем сайты для ДНК-связывающих белков. Эта модификация метода также имела ряд недостатков.
Во-первых, это ограниченность сайтов гидролиза гомопурин- гомопиримидиновыми последовательностями. Использование RecA- опосредованных триплексов в качестве защитного агента позволяет осуществлять гидролиз в произвольно выбранных сайтах эндонуклеаз рестрикции, поскольку RecA-белок способствует специфичному связыванию олигонуклеотидов произвольной последовательности с двуцепочечной ДНК ( Ferrin L.J. and Camerini-Otero R.D., 1991 ). Но этот метод пока что не внедрен в практику, поскольку хорошо очищенный RecA-белок малодоступен.
Во-вторых, для того, чтобы образованный олигонуклеотидом триплекс был достаточно стабилен, чтобы защитить сайт от мети- лирования, приходилось использовать достаточно длинные олиго- нуклеотиды (около 20 п.о.). Это связано с тем, что для работы метилаз часто требуется рН среды, близкий к нейтральному ( Strobel S.A. and Dervan P.B., 1991 , Maher L.J. ea, 1989 ). Для защиты от метилаз, которые способны работать при кислых рН, можно обходиться меньшей длиной (в работе Hanvey J.C. ea, 1989 - 12 п.о.). Чтобы обеспечить прочное связывание при нейтральных рН, использовались аналоги олигонуклеотидов, в которых цитозин был заменен на 5-метилцитозин ( Strobel S.A. and Dervan P.B., 1991 , Maher L.J. ea, 1989 ). Но даже в этом случае для полноценной защиты требовалась большая длина олигонуклеотида и, кроме того, перекрывание его сайта связывания с защищаемым сайтом. Попытки использовать для защиты от метилирования триплексы Pu-Py-Pu типа окончились неудачей.
Последовательность длиной в 20 пар повторяется слишком редко в геномной ДНК. Поэтому метод "Ахиллесовой пяты" с использованием олигонуклеотидов не получил широкого практического применения.
Ранее было показано, что ПНК способна ингибировать эндонуклеазы рестрикции, имеющие сайты узнавания, непосредственно контактирующие с сайтами связывания ПНК ( Nielsen P.E. ea, 1993a ). В той же работе было высказано предположение, что ПНК способна ингибировать и метилазы. Благодаря более прочному связыванию с ДНК, по сравнению с олигонуклеотидами ( Egholm M. ea, 1992b ), для формирования прочного комплекса ПНК-ДНК можно использовать ПНК меньшей длины. Это позволяет надеяться на то, что ПНК окажется подходящим агентом для создания искусственных редкощепящих рестриктаз на основе метода "Ахиллесовой пяты".
На основе ПНК ранее уже был предложен другой метод внесения двухцепочечных разрывов, позволяющий гидролизовать ДНК в редко расположенных сайтах ( Demidov V.V. ea, 1993 ). Он основан на том, что ПНК, связываясь с одной из нитей ДНК, оставляет другую нить в одноцепочечном состоянии. Таким образом, образовавшийся одноцепочечный участок может быть мишенью для S1-нуклеазы. Последовательности, непосредственно прилегающие к расплетенному с помощью ПНК участку, сами склонны к спонтанному расплетению, поэтому они также подвергаются гидролизу. Таким образом, возникает двухцепочечный разрыв. Недостатком этого метода является неспецифичность связывания ПНК и, кроме того, его применение требует достаточно большой концентрации нуклеазы S1. Длинные молекулы ДНК часто содержат большое количество случайных однонитевых разрывов, поэтому при обработке высокой концентрацией S1 нуклеазы они сильно разрушаются.
В работе ( Красильникова М.М., 1995 ) предложено усовершенст- вование этого метода, позволяющее применять его также для гидролиза длинных ДНК.
