Применение ПНК
Рассматривая ПНК в качестве потенциального агента для использования в медицинских и молекулярно-биологических целях, необходимо остановиться на свойствах, благоприятствующих и препятствующих такому применению.
Среди положительных качеств - способность внедряться в двойную спираль ДНК ( Nielsen P.E. ea, 1991 , Cherny D.Y. ea, 1993 , Demidov V.V. ea, 1994b ); исключительная прочность связывания ( Nielsen P.E. ea, 1991 , Egholm M. ea, 1992a , Egholm M. ea, 1992b , Cherny D.Y. ea, 1993 ); стабильность комплексов ПНК-ДНК при физиологических условиях ( Cherny D.Y. ea, 1993 ); устойчивость ПНК к действию широкого спектра нуклеаз и протеиназ и стабильность в клеточных экстрактах Demidov V.V. ea, 1994a ).
Прочность (ПНК)2ДНК триплекса была использована для блокирования элонгации транскрипции, а также для остановки репликации в месте связывания ПНК (остановка транскрипции была исследована на примере РНК-полимеразы Т3 ( Nielsen P.E. ea, 1993b ), а также РНК-полимеразы II в системах in vitro ( Hanvey J.C. ea, 1992 ); остановка репликации - на примере ДНК-полимеразы Taq при синтезе на однонитевой матрице in vitro ( Nielsen P.E. ea, 1993b ). ПНК также способна останавливать трансляцию, специфически связываясь с РНК по дуплексному типу. Этот подход был осуществлен в системе in vivo, где с помощью микроинъекции ПНК в клетки специфично подавлялся синтез определенного белка ( Hanvey J.C. ea, 1992 ).
Способность ПНК образовывать одноцепочечные участки на ДНК при связывании со своей комплементарной мишенью была использована для создания искусственных промоторов с помощью ПНК ( Mollegaard N.E. ea, 1994 ). Оказалось, что для инициации транскрипции с помощью РНК-полимеразы E-coli, а также фага Т7 в системе in vitro достаточно расплетенного участка, петлевой структуры на ДНК. Была проверена возможность использования для этих целей D-петель , образуемых ПНК. Выяснилось, что транскрипция эффективно инициируется (на уровне сильных природных промоторов) не только с помощью РНК-полимеразы E-coli, но и с помощью ядерного экстракта из клеток крысы. Причем в качестве матрицы используется не та нить, которая находится в комплексе с ПНК, а комплементарная. Таким образом, ПНК может как блокировать транскрипцию ( Nielsen P.E. ea, 1993b , Hanvey J.C. ea, 1992 ), так и способствовать ее инициации ( Mollegaard N.E. ea, 1994 ).
Еще один метод с применением ПНК, анализ одиночных мутаций с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), основан на том, что ПНК является неприродным соединением и не может использоваться ДНК-полимеразой в качестве праймера ( Orum H. ea, 1993 ). Для того, чтобы определить наличие мутаций в цепи ДНК, был синтезирован достаточно длинный праймер для PCR (включающий исследуемую на мутации позицию), а также ПНК, способная конкурировать с праймером. В рассматриваемой работе потребовался праймер не менее 23 п.о. и ПНК длиной 15 п.о. Отжиг праймера проводили в два этапа: вначале поддерживалась более высокая температура, подобранная для отжига ПНК (по дуплексному типу), а затем более низкая для отжига праймера. В случае отсутствия мутаций ПНК полностью блокирует отжиг праймера. Если же имеется мутация, более длинный олигонуклеотид успешно конкурирует с ПНК, и появляется PCR-продукт ( Orum H. ea, 1993 ).
Одним из интереснейших применений ПНК является создание искусственной редкокощепящей рестриктазы на основе ПНК. Большинство природных эндонуклеаз рестрикции узнает последовательности ДНК из 4-6 нуклеотидов. Ферменты, узнающие 8- 10 нуклеотидов, встречаются достаточно редко, и класс узнаваемых ими последовательностей весьма ограничен. В то же время, в связи с изучением длинных геномных ДНК и, в частности, с проектом секвенирования человеческого генома, возникла необходимость специфического гидролиза ДНК в редко расположенных сайтах. Возможные подходы к проблеме использования ПНК для создания искусственных редкощепящих рестриктаз подробно обсуждаются в разделе Создание искусственных редкощепящих рестриктаз .
Теперь обратимся к препятствиям, возникающим при использовании ПНК, и возможностям их преодоления.
Во-первых, для решения многих прикладных задач желательно осуществлять внедрение ПНК при физиологических условиях. Это может вызвать затруднения, поскольку эффективное внедрение может происходить только при достаточно низкой ионной силе среды ( Cherny D.Y. ea, 1993 ). Однако, при существенном увеличении конценрации ПНК или увеличении времени связывания можно добиться 100% связывания ПНК со всеми сайтами и в физиологических условиях ( Demidov V.V. ea, 1995 ). В качестве другого подхода к этой проблеме можно отметить связывание ПНК с ДНК в условиях низкой ионной силы, а затем использование полученных комплексов в физиологических условиях. Таким образом используется их стабильность при высокой ионной силе ( Cherny D.Y. ea, 1993 ). Именно такой подход применялся в рассмотренных выше работах ( Nielsen P.E. ea, 1993a , Mollegaard N.E. ea, 1994 , Hanvey J.C. ea, 1992 , Nielsen P.E. ea, 1993b ).
Определенную сложность представляет то, что ПНК, содержащие как тимины, так и цитозины, гораздо эффективнее связываются при кислых pH, чем при нейтральных ( Egholm M. ea, 1992b ). Видимо, по аналогии с триадой CGC+ обычных ДНК-триплексов, соответству- ющая гибридная ПНК-ДНК триада требует протонирования. Эта проблема была полностью решена с помощью использования недавно разработанных ПНК, в которых цитозины заменены на псевдоизоцитозины ( Egholm M. ea, 1995 ). Ранее уже было показано, что замена цитозина на псевдоизоцитозин снимает pH-зависимость триплекса, практически не влияя на его стабильность.
Возможности использования ПНК in vivo в значительной степени ограничивает то, что ПНК практически не проникает в живую клетку. Снятие этого ограничения привело бы к значительному расширению спектра применения ПНК. Поэтому ведущие группы по исследованию ПНК сейчас занимаются решением этой проблемы.
Другой серьезной проблемой в применении ПНК является недостаточная специфичность связывания. Это общая проблема, характерная как для олигонуклеотидов, так и для ПНК, при этом более сильное связывание приводит к потере в специфичности. Для эффективного использования ПНК во многих прикладных задачах необходимо повысить специфичность связывания ПНК с ДНК. Перейдем к более подробному рассмотрению этого вопроса.
