PNA: взаимодействия по триплексному типу
Гомопиримидиновые ПНК взаимодействуют с олигонуклеотидом по триплексному типу - 2 молекулы ПНК и одна молекула ДНК. При этом нити ПНК образуют достаточно стабильные триплексы как в параллельной, так и в антипараллельной ориентации относительно нити ДНК. По последним, еще не опубликованным данным, наиболее стабильные триплексы образуются в случае, если одна из нитей антипараллельна, а другая параллельна ДНК ( Egholm M. ea, 1995 ). Четких, однозначно интерпретируемых данных по сравнению триплексов с различными ориентациями ПНК пока не было в печати. Есть указания ( Peffer J.P. ea, 1993 ), что параллельная ориентация немного предпочтительнее (обе нити ПНК параллельны ДНК).
С точки зрения своей структуры триплексы с участием ПНК сильно напоминают обычные ДНК триплексы ( Kim S.K. ea, 1993 ). С помощью анализа спектров кругового дихроизма было установлено, что (ПНК)2ДНК триплекс представляет собой правую спираль. Кроме того, путем анализа спектров линейного дихроизма было получено, что отклонения положения оснований от перпендикуляра по отношению к оси спирали достаточно мало. Конформация оснований в (ПНК)2ДНК триплексе практически не отличается от их конформации в ДНК-триплексе. Стехиометрия комплексов уточнялась с помощью титрования по поглощению в ультрафиолете и по измерениям линейного дихроизма. Интересно, что при этом исследователям не удалось детектировать образование дуплексов при стехиометрическом соотношении 1:1 ( Kim S.K. ea, 1993 ).
Выдающимся свойством (ПНК)2ДНК триплексов является их исключительная стабильность. Их температура плавления составляет 70 - 80 *градусов С ( Egholm M. ea, 1992a , Egholm M. ea, 1992b ). Возможно, этим объясняется характер взаимодействия ПНК с двухцепочечной ДНК ( Nielsen P.E. ea, 1991 ). В отличие от олигонуклеотидов, которые при взаимодействии с ДНК ложатся в большую бороздку двойной спирали, ПНК расплетает нити ДНК, образует триплекс с одной из нитей, оставляя другую в одноцепочечном состоянии. Петли, образующиеся при взаимодействии ПНК Т10 с плазмидной ДНК, содержащей последовательность А98, были зарегистрированы методом электронной микроскопии ( Cherny D.Y. ea, 1993 ). Связывание ПНК с 10-ти нуклеотидными сайтами также можно наблюдать с помощью электронного микроскопа, но для этого необходимо использовать биотинилированные ПНК, хорошо заметные по связыванию электронномикроскопического маркера - стрептавидина ( Demidov V.V. ea, 1994b ).
Связывание ПНК чрезвычайно прочно и образующиеся комплексы очень стабильны ( Nielsen P.E. ea, 1991 , Cherny D.Y. ea, 1993 ). Они имеют время полураспада, значительно превышающее 24 часа, и не разрушаются при стандартной процедуре переосаждения этанолом ( Nielsen P.E. ea, 1993a ). Кроме того, они стабильны в высокой соли (более 0,5 М NaCl), хотя для образования комплексов с двуцепочечной ДНК необходима невысокая концентрация соли (не более 40мМ по NaCl) ( Cherny D.Y. ea, 1993 ). Видимо, это связано с необходимостью расплетания двойной спирали, стабильность которой выше в высокой соли. В пользу этой гипотезы то, что можно другими способами увеличить вероятность фиксации расплетенного участка с помощью ПНК-триплекса. Например, если сильно увеличить время связывания, то ПНК все-таки можно внедрить в высокой концентрации соли. Так, за 20 часов в 100мM NaCl можно достичь 50-процентного связывания ( Egholm M. ea, 1995 ). Кроме того, при достаточно высокой концентрации ПНК (350мкМ) при 150мМ NaCl за 1 час ПНК связывается с 50 процентами сайтов, а при концентрации ПНК 500мкМ в тех же условиях за то же время ПНК связывается полностью, со всеми сайтами ( Demidov V.V. ea, 1995 ).
Для изучения механизмов образования комплексов ПНК с двухцепочечной ДНК была исследована кинетика связывания ПНК с ДНК. Выяснилось, что экспериментальные кривые соответствуют следующей зависимости константы скорости реакции псевдо-первого порядка k от концентрации ПНК ( Demidov V.V. ea, 1995 ):
Авторами была предложена кинетическая схема, соответствующая экспериментальным данным. Согласно этой схеме, (смотри Рис. Схема образования комплекса ПНК с двухцепочечной ДНК ) на первом этапе происходит частичное расплетание двойной спирали ДНК и образование промежуточного продукта DP, представляющего собой короткоживущий дуплекс ПНК-ДНК. Затем этот дуплекс фиксируется третьей нитью ПНК, и образуется стабильный триплекс DP2. В случае, если ПНК содержит участки повторяющихся последовательностей, возможны дополнительные стадии. На начальном этапе ПНК может образовать с ДНК не полностью специфичный, так называемый "сдвинутый" дуплекс DP*, соответствующий расплетенному в данный момент участку ДНК. Этот дуплекс может затем превратиться в "неправильный триплекс" DP*2*, не столь стабильный вследствие того, что он охватывает лишь часть потенциальной триплексобразующей последовательности. Поскольку образование этой структуры способствует расплетанию прилегающих участков ДНК, которые могли бы участвовать в образовании правильного триплекса, этот неправильный триплекс в дальнейшем может быть вытеснен совершенным триплексом, в котором задействованы все основания ПНК.
Теоретическая обработка этой схемы с использованием метода квазистационарных концентраций при простейших предположениях о малых временах жизни промежуточных комплексов и постоянстве концентрации ПНК позволила аппроксимировать константу псевдо- первого порядка многочленом от концентрации ПНК (Р), представляющим сумму квадратичного и кубичного членов с соответствующими коэффициентами. Это соответствует приведенной выше экспериментальной зависимости с коэффициентом y в диапазоне 2 меньше y меньше 3. Вклад "сдвинутых" комплексов отражает кубичный член, что находится в соответствии с экспериментальными данными, состоящими в том, что для полностью симметричной ПНК с последовательностью Т10 y=2,2, а для ПНК с последовательностью Т2CТ2СТ4, обладающей меньшей регулярностью, y=2,5 ( Demidov V.V. ea, 1995 ).
Таким образом, ПНК обладает исключительно интересным свойством внедряться в заданное место двойной спирали ДНК, образуя с ней очень прочный комплекс. Благодаря этому, ПНК имеет перспективы использования в качестве агента, способного влиять на процессы, происходящие в клетке, с помощью взаимодействия с ДНК и РНК. ПНК может оказаться полезной в медицине для генной терапии, а также в молекулярной биологии как инструмент для внесения специфичных к последовательности изменений в ДНК. Далее рассмотрим свойства ПНК с точки зрения ее применения для различных целей in vivo и in vitro, а также примеры такого использования, смотри Применение ПНК .
