Проектирование последовательности третьей цепи
Для каждой последовательности ДНК, гомопуриновой по первой цепи и гомопиримидиновой по второй цепи, существует 4 основных типа третьих цепей, способных образовать с этой ДНК тройную спираль :
# параллельные СТ-содержащие (СТ), (а),
# параллельные GT-содержащие (GТ), (б),
# антипараллельные GT-содержащие (GТ), (в) и
# антипараллельные AG-содержащие (AG), (г). На рисунке представлены примеры различных вариантов тройных спиралей с одной и той же последовательностью ДНК-мишени: а
5'...TTCTCCCTCCTTTTCCTCTC...3' третья цепь
********************
5'...AAGAGGGAGGAAAAGGAGAG...3' первая цепь
||||||||||||||||||||
3'...TTCTCCCTCCTTTTCCTCTC...5' вторая цепь б
5'...TTGTGGGTGGTTTTGGTGTG...3' третья цепь
********************
5'...AAGAGGGAGGAAAAGGAGAG...3' первая цепь
||||||||||||||||||||
3'...TTCTCCCTCCTTTTCCTCTC...5' вторая цепь в
3'...TTGTGGGTGGTTTTGGTGTG...5' третья цепь
********************
5'...AAGAGGGAGGAAAAGGAGAG...3' первая цепь
||||||||||||||||||||
3'...TTCTCCCTCCTTTTCCTCTC...5' вторая цепь г
3'...AAGAGGGAGGAAAAGGAGAG...5' третья цепь
********************
5'...AAGAGGGAGGAAAAGGAGAG...3' первая цепь
||||||||||||||||||||
3'...TTCTCCCTCCTTTTCCTCTC...5' вторая цепь
Разумеется, допустимы и смешанные типы последовательности третьей цепи: CTG-содержащие в случае параллельной тройной спирали ( Giovannangeli C. ea, 1992 ) и GTA-содержащие в случае антипараллельной . Интересно отметить, что третьи цепи типов ##СТ и AG для одной и той же последовательности-мишени взаимно комплементарны и антипараллельны, что дает им возможность образовать друг с другом обычную двойную спираль . Это свойство понадобится нам в дальнейшем.
Существуют ли какие-либо принципы или рекомендации, на основании которых можно было бы сделать выбор между разными вариантами последовательности третьей цепи при планировании экспериментов по подавлению экспрессии конкретного гена? К сожалению, сегодняшнее состояние теории тройных спиралей и малое количество экспериментальных данных не позволяют ответить на этот вопрос однозначно.
В настоящее время наиболее полно изучены параллельные тройные спирали с третьими цепями типа СТ, поэтому многие авторы предпочитают использовать их в экспериментах in vitro, главным образом в тех случаях, когда допустимо небольшое смещение рН в кислую область ( Maher III L.J. ea, 1992 , Alunni-Fabbroni M. ea, 1994 ). Однако, малое время жизни таких спиралей при физиологических значениях рН делает успех их применения in vivo несколько сомнительным.
Тип ##GТ третьей цепи, по-видимому, имеет смысл использовать, если последовательность ДНК-мишени состоит из чередующихся олиго(А) и олиго(G) моноблоков c преобладанием адениновых оснований ( Scaggiante B. ea, 1994 ). Примером может послужить последовательность GGAAAAAGGGAAAA. Если же доля таких блоков в последовательности-мишени невелика, то тройной комплекс, как правило, не образуется или образуется с низкой эффективностью ( Beal P.A. and Dervan P.B., 1991 , Durland R.H. ea, 1991 ). В этом случае рекомендуется выбирать антипараллельные варианты третьей цепи.
Антипараллельные тройные спирали, будучи нечувствительными к кислотности среды, по-видимому, наиболее подходят для исследований in vivo. Различия в устойчивости антипараллельных спиралей с третьими цепями типов ## AG и GТ невелики и зависят от последовательности нуклеотидов мишени и параметров среды [51]. В среднем AG-комлексы проявляют бoльшую стабильность в условиях, близких к физиологическим [52, 53]. Вместе с тем, в силу сложившегося в литературе мнения многие исследователи с недоверием относятся к возможности формирования антипараллельных тройных спиралей, если в качестве третьей цепи предстоит использовать РНК ( McDonald C.D. and Maher III L.J., 1995 ).
Довольно часто в распоряжении исследователя имеется последовательность двуспиральной ДНК, в которой первая цепь обогащена пуринами, но не состоит из них целиком. Пригодна ли такая последовательность для образования тройных спиралей того или иного типа? В литературе существуют данные, позволяющие дать положительный ответ на этот вопрос: ограничения, налагаемые правилом о гомопуриновом составе первой цепи ДНК-мишени, можно обойти. Так, согласно результатам исследований с применением ядерного магнитного резонанса Radhakrishnan I. and Patel D.J., 1994 , параллельные тройные спирали могут включать неканонические триады G*Т-А и T*C-G, каждая из которых стабилизирована одной водородной связью между нуклеозидами первой и третьей цепей. Тем самым список допустимых оснований в последовательности первой цепи расширяется и охватывает все 4 возможных варианта. Разумеется, такая структура может быть стабильной в целом, только если доля неканонических триад в тройном комплексе относительно мала.
Аналогичным образом обстоит дело и с антипараллельными тройными спиралями. Подставляя в фиксированное положение спирали все возможные сочетания трех нуклеозидов, Бил и Дерван показали возможность формирования тройного комплекса, содержащего неканоническую триаду Т*C-G ( Beal P.A. and Dervan P.B., 1992 ). В работе Била и Дервана не было обнаружено варианта нуклеозида третьей цепи, который подходил бы для пары Т-А в дуплексе-мишени. Однако, если не ограничиваться природными вариантами нуклеозидов, то и это препятствие становится преодолимым. В частности, Дурланд и соавторы ( Durland R.H. ea, 1995 ) продемонстрировали хорошее связывание синтетического аналога пиразол-2'-дезоксирибо- нуклеозида и других нуклеозидных аналогов на основе производных азола с парами C-G и, в особенности, Т-А в составе антипараллельного тройного комплекса. Таким образом, и в случае антипараллельных спиралей допустимо присутствие небольшого числа пиримидинов в первой цепи.
Дополнительным классом последовательностей, в принципе способных участвовать в формировании тройной спирали, являются дуплексы, состоящие из чередующихся достаточно длинных гомопуриновых и гомопиримидиновых блоков. Джаясена и Джонсон показали ( Jayasena S.D. and Johnston B.H., 1993 ), что участок двуспиральной ДНК с последовательностью первой цепи типа 5'-(R)n(Y)m-3', где R- пуриновые , а Y- пиримидиновые основания, может образовать тройной комплекс, если третья цепь имеет последовательность 5'-(Y)n(R)m-3'. В этом случае первые n триад комплекса составляют параллельную тройную спираль, а последующие m триад - антипараллельную тройную спираль, причем третья цепь переключает связывание и находится в комплексе сначала с первой, а затем со второй цепью дуплекса.
