Простагландин F синтаза: каталитическая активность
При использовании в качестве субстратов различных кетопростагландинов и PGH2 активность фермента (рассчитывалась из скорости окисления NADPH) падала согласно следующему порядку: PGD2 (100%)< PGH2 (44%)< PGJ2 (32%)< PGA2 (26%)< PGE2 = PGB2 (6%). Сравнение значений KM для исследуемых субстратов показало, что наиболее специфическим субстратом является PGH (KM=10мкМ; для сравнения KM для PGD2=120мкМ). При этом активность фермента с нитроацетофеноном , менадионом и фенантренохиноном была, по крайней мере, в 3 раза выше, чем с PGD2. По результатам гель-фильтрации, электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), иммунотитрования с использованием антител к очищенному ферменту было показано, что PGF-синтазная, PGD-11- кеторедуктазная и карбонилредуктазная активности соответствуют одному белку. Фенантрохинон вызывал субстратное конкурентное ингибирование PGD- редуктазной активности, а PGD2 - конкурентное ингибирование карбонилредуктазной активности PGF синтазы. В то же время ни PGD2, ни фенантрохинон не влияли на PGF-синтазную активность фермента. На основе этих результатов сделано предположение о существовании двух независимых реакционных центров в молекуле PGF синтазы, один из которых соответствует PGD- и карбонилредуктазной функции, а другой - PGF-синтазной функции фермента.
Как PGF-синтазная, так и PGD-редуктазная, и карбонилредуктазная активности фермента имели строгий NADPH -зависимый характер реакции. Структурный анализ (MS/GC) продуктов ферментативного восстановления PGD2 и PGH2 показал, что в ходе PGD-11-кеторедуктазной реакции образуется 9альфа, 11бета-PGF2 , а в ходе PGF-синтазной реакции - 9альфа,11альфа-PGF2альфа .
Во всех известных случаях PGF синтаза обладала и PGD-11- кеторедуктазной, и карбонилредуктазной активностями. Обнаружение многофункциональности этого типа ферментов делает закономерным вопрос о существовании отдельного типа узкоспецифических PGD-11-кеторедуктаз. Ферменты, обладающие PGD-11-кеторедуктазной активностью, были обнаружены ранее в легких крысы ( Watanabe K., 1981 ) и печени кролика ( Wong , 1981) и позже в печени человека (DD2 изофермент 3-альфа- гидроксистероид/дигидродиол дегидрогеназы; Ohara, 1994 ). Однако отсутствие данных о наличии в препаратах ферментов PGF-синтазной и неспецифической карбонилредуктазной активности не позволяет утверждать, что они представляют собой отличный от PGF синтаз легких и печени быка тип ферментов. Касаясь рассмотрения специфичности этого типа ферментов, уместно обратить внимание на очень существенную ошибку, допускаемую многими авторами ( Watanabe K., 1981 ; Wong, 1981 ) и создающую впечатление о существовании еще одного типа ферментов. Она заключается в неверном отнесении структуры продукта восстановления PGD2 в ходе PGD-11- кеторедуктазной активности: ему приписывалась структура 9aльфа,11aльфа- PGF2aльфа, тогда как в последующих работах при исследовании PGF синтаз и метаболизма PGD2 в различных тканях и клетках млекопитающих ( Liston, 1985 ; Pugliese, 1985 ; Watanabe K., 1986 ; Seibert, 1987 ; Beasley, 1987 ; Wendelborn, 1988 ; Parsons, 1988 ) этот продукт был идентифицирован как 9альфа,11бета-PGF2 .
