X-Инактивация; ES-клетки как модельная система
Последовательность событий, приводящих к X-инактивации; ES-клетки как модельная система.
Мышиные ES-клетки оказались бесценной модельной системой для исследования динамики инактивации Х-хромосомы. Повышенные уровни Xist-РНК и то, как она покрывает одну из Х-хромосом, впервые обнаруживаются в большой доле клеток спустя 1-2 дня дифференцировки. Имеются данные о том, что в апрегуляции Xist играют роль как транскрипционные, так и посттранскрипционные механизмы ( Panning et al., 1997 ; Sheardown et al., 1997 ; Rougeulle et al., 2004 ). Однако в недифференцированных женских ES-клетках Xist транскрибируется с обеих Х-хромосом, а в мужских - с единственной X, но продукт транскрипции, РНК, быстро деградирует, и лишь небольшие его количества выявляются по соседству с локусом Xist. Были представлены данные о том, что по мере дифференцировки имеет место стабилизация Xist-РНК на одной из двух Х-хромосом женских клеток ( Panning et al., 1997 ; Sheardown et al., 1997 ). Механизм, лежащий в основе этого этапа избирательной стабилизации РНК, остается неизвестным, как и его вклад в общее увеличение содержания Xist-PHK и в покрытие ею хромосомы в cis-конфигурации.
Было обнаружено, что ряд этапов Х-инактивации совпадает с началом аккумуляции Xist-РНК в дифференцирующихся ES-клетках XX. В их число входят рекрутирование белков PcG и ассоциированное с этим метилирование НЗК27, моноубиквитинирование Н2A, деацетилирование НЗК9 и утрата метилирования в НЗК4 ( Heard et al., 2001 ; Silva et al., 2003 ; de Napoles et al., 2004 ; Rougeulle et al., 2004 ). Глобальное деацетилирование гистонов - относительно позднее событие, происходящее в большинстве клеток на 3-5-й день; поэтому весьма вероятно, что оно участвует в поддержании и (или) стабилизации неактивного состояния, а не в его инициации ( Keohane et al., 1996 ). Такая трактовка предполагает, что паттерны ацетилирования в промоторах отдельных генов, претерпевающих инактивацию, отражают паттерны, определяемые с помощью иммунофлуоресцентного анализа целой хромосомы или крупных доменов. Первоначальные исследования с использованием ChIP , заставляют предполагать, что это действительно так, однако необходимы дальнейшие эксперименты с вовлечением большего числа генов ( O'Neill et al., 2003 ).
Аккумуляция вариантного гистона macroH2A1.2 на Xi происходит в ходе дифференцировки ES-клеток XX гораздо позже ( Mermoud et al., 1999 ). Этот вариантный гистон имеет более 200 дополнительных аминокислотных остатков в своем карбокситерминальном конце и несколько аминокислотных замен по всей молекуле. Интересно, что в соматических клетках экспрессия Xist-PHK требуется для того, чтобы сохранить macroH2A на Xi ( Csankovszki et al., 1999 ), но ее недостаточно, чтобы рекрутировать macroH2A на ранних этапах дифференцировки ( Mermoud et al., 1999 ; Wutz et al., 2002 ).
Избирательное метилирование ДНК на Xi - еще более позднее событие в ES-клетках. Динуклеотиды CpG, о которых известно, что они высокометилированы на Xi во взрослых клетках, не становятся метилированными в женских ES-клетках до гораздо более поздних стадий дифференцировки, 14-21-го дня ( Keohane et al., 1996 ). Это согласуется с результатами в самом развивающемся эмбрионе ( Lock et al., 1987 ) и с идеей, согласно которой метилирование ДНК отвечает за стабилизацию, или фиксацию неактивного состояния, а не участует в инициации и распространении.
Таким образом, возникающая картина - это картина скоординированной и тщательно регулируемой последовательности событий, посредством которых изменения хроматина на Xi помещаются на место по мере развития (суммировано на рис. 17.8 ). Замечательно, что некоторые из этих изменений, например деацетилирование гистонов и метилирование ДНК, происходят после того, как клетки начали продвигаться по различным дифференцировочным путям. Создается впечатление, что программа, отвечающая за завершение [completion] Х-инактивации, выполняется независимо от других программ клеточной дифференцировки. Важно, однако, отметить, что в некоторых аспектах случайная Х-инактивация может происходить только после того, как дифференцировка началась. Например, включение экспрессии Xist-трансгенов в недифференцированных ES-клетках переключает различные модификации гистонов, ассоциированные с гетерохроматинизацией, а также переход к репликации в поздней S-фазе ( Wutz and Jaenisch, 2000 ), но сколько-нибудь заметное включение macroH2A отсутствует; только после того как индуцирована дифференцировка клеток, macroH2A ко-локализуется с Xist-РНК на хромосоме, содержащей трансген Xist ( Rasmussen et al., 2001 ). Ассоциация macroH2A с хроматином, покрытым Xist, зависит от постоянного присутствия Xist-РНК ( Csankovszki et al., 1999 ), но не требует транскрипционного сайленсинга, поскольку она видна также в хромосомах, покрытых мутантной Xist-РНК, лишенной районов, необходимых для сайленсинга ( W utz et al., 2002и). Таким образом, Х-инактивация может рассматриваться как конечный результат серии параллельных процессов, из которых лишь некоторые являются взаимозависимыми.
Важно подчеркнуть, что конкретные энзиматические комплексы или модификации гистонов могут играть критическую роль на определенных этапах процесса Х-инактивации, но могут становиться менее важными или избыточными позднее, возможно, после того, как более постоянные механизмы сайленсинга, основанные на метилировании ДНК, будут помещены в нужное место. Например, метилирование НЗК27, катализируемое PRC2 , является существенным для успешной Х-инактивации на ранних этапах онтогенеза, но необязательным в более поздние сроки.
Следует также отметить, что в ходе установления импринтированной Х-инактивации у предимплантационных эмбрионов может иметь место иной порядок событий. В частности, обогащение НЗК27mеЗ не обнаруживается до 16-клеточной стадии, значительно позже начала экспрессии Xist (стадия 24 клеток) ( Мак et al., 2004 ; Okamoto et al., 2004 ). Это может указывать на потребность в специфических, регулируемых в развитии кофакторов для рекрутирования комплекса PRC2 PcG к Xi.
