Геномный импринтинг у млекопитающих: ключевые исследования
Важный шаг к установлению существования геномного импринтинга у млекопитающих был сделан в восьмидесятые годы прошлого столетия с разработкой улучшенной технологии ядерных пересадок, с помощью которой тестировалась возможность получения диплоидных однородительских эмбрионов с использованием исключительно ядер из мышиных яйцеклеток. С помощью техники ядерных пересадок донорский мужской или женский пронуклеус извлекали из только что оплодотворенной яйцеклетки и тонкой микропипеткой переносили его внутрь оплодотворенной яйцеклетки хозяина, из которой был предварительно удален материнский или отцовский пронуклеус. Таким путем воссоздавались диплоидные эмбрионы, с той лишь разницей, что они обладали двумя материнскими или двумя отцовскими геномами (известные, соответственно, как гиногенетические и андрогенетические эмбрионы) ( рис. 19.2 ). Эта техника была вначале использована для того, чтобы показать, что ядра от оплодотворенных мутантных эмбрионов Hairpin-tail нельзя было "спасти", пересадив их в хозяйскую яйцеклетку дикого типа. Это доказывало, что именно геном эмбриона, а не цитоплазма ооцита, несет дефект Hairpin-tail. Это также подтверждало предположение о том, что гены на материнской и отцовской копиях хромосомы 17 функционируют по-разному в ходе эмбрионального развития ( McGrath and Solter, 1984c ). Впоследствии ядерные пересадки были использованы, чтобы продемонстрировать, что эмбрионы, реконструированные из двух материнских пронуклеусов (известные как гиногенетические эмбрионы) или двух отцовских пронуклеусов (андрогенетические эмбрионы), были нежизнеспособными; только эмбрионы, реконструированные из одного материнского и одного отцовского пронуклеуса давали жизнеспособное и фертильное потомство ( McGrath and Solter, 1984а ; Surani et al., 1984 ). Эта работа опровергла предшествующее мнение, что однородительские мыши могут развиваться до взрослого состояния ( Норре and Illmensee, 1982 ). Гиногинетические эмбрионы в момент гибели были дефектными по экстраэмбриональным тканям, которые входят в состав плаценты, а андрогенетические эмбрионы были дефектными по эмбриональным тканям. Это привело к гипотезе о том, что для эмбрионального развития требуются импринтированные гены, экспрессируемые с материнского генома, тогда как отцовский геном экспрессирует импринтированные гены, необходимые для экстраэмбрионального развития ( Barton et al., 1984 ). Последующая идентификация импринтированных генов у мыши не подтвердила такое смещение в функционировании импринтированных генов, показывая, что наблюдаемые различия между гиногенетическими и андрогенетическими эмбрионами можно объяснить доминантным эффектом одного или нескольких импринтированных генов.
Эксперименты с пересадкой ядер, в сочетании с подкрепляющими данными генетики мышей, дали убедительное доказательство того, что для эмбриогенеза у мышей требуются оба родительских генома, и заложили прочный фундамент для существования геномного импринтинга у млекопитающих ( рис. 19.2 ). Широкий обзор вкладов родительских хромосом в эмбриональное развитие с использованием "транслокационных" мышей для создания UPD -хромосом ( рис. 19.1 ) позволили идентифицировать у мыши два участка на хромосомах 2 и 11, которые демонстрировали противоположные фенотипы, когда присутствовали в виде двух материнских либо двух отцовских копий. Это еще более усилило доводы в пользу экспрессии специфичных в отношении родителя генов у млекопитающих ( Cattanach and Kirk, 1985 ). Кроме того, накапливались клинические данные по генетике человека, которые убедительно свидетельствовали о том, что некоторые генетические состояния, в особенности синдром Прадера-Уилли (Prader-Willi), который, по-видимому, возникает исключительно путем передачи от отца, лучше всего объясняются экспрессией генов, специфичных в отношении родителя ( Reik, 1989 ).
Дальнейшие ключевые данные были получены в результате применения вновь разработанной технологии получения трансгенных мышей путем микроинъекции генных последовательностей в оплодотворенные яйцеклетки мышей. Этому нередко препятствовала проблема метилирования ДНК , неожиданно вызывающего сайленсинг трансгена в соматических тканях. Эта "проблема", однако, придала вес аргументам в пользу того, что родительские хромосомы ведут себя различно, когда было показано, что некоторые трансгены обнаруживают специфичные в отношении родителя различия по их способности приобретать метилирование ДНК. Обычно трансгены, переданные матерью [maternal-transmitted transgenes], метилировались, тогда как трансгены, переданные отцом, - нет. Однако лишь в нескольких случаях различия в метилировании ДНК коррелировали со специфичной в отношении родителя экспрессией. Хотя позднее было обнаружено, что существуют многочисленные черты сходства между импринтингом метилирования "трансгена" и геномным импринтингом эндогенных генов у мышей, по некоторым признакам они различаются ( Reik et al., 1990 ). К их числу относятся высокая чувствительность к эффектам фона, что в большинстве случаев требует смешанного генетического фона для выявления импринтированного поведения, неспособность поддерживать импринтированную экспрессию в разных сайтах интеграции хромосом и потребность в чужеродных нуклеотидных последовательностях ДНК для производства импринтированного эффекта ( Chaillet et al., 1995 ).
Несмотря на обилие данных в пользу существования геномного импринтинга у млекопитающих его окончательное доказательство зависело от идентификации генов, демонстрирующих специфичную в отношении родителя экспрессию. Это случилось в 1991 году, когда были описаны три импринтированных гена мыши. Первый из них, Igf2r (Insulin-like growth factor type 2 receptor, то есть рецептор-"мусорщик" ["scavenger" receptor] для ростового гормона Igf2 ), был идентифицирован как матерински экспрессируемый импринтированный ген. Позднее было показано, что этот ген объясняет фенотип чрезмерного роста мутанта Hairpin-tail у мышей ( Barlow et al., 1991 ). Спустя несколько месяцев ген Igf2 (Insulin-like growth factor type 2), о котором было известно, что он функционирует как гормон роста, был идентифицирован как отцовски экспрессируемый импринтированный ген ( DeChiara et al., 1991 ; Ferguson-Smith et al., 1991 ). Наконец, впоследствии было показано, что ген Н19 (клон 19 сДНК, выделенный из библиотеки фетальной печени), необычная некодирующая РНК ( ncRNA ), является матерински экспрессируемым импринтированным геном. Чтобы идентифицировать эти три импринтированных гена, были использованы разнообразные стратегии, каждая из которых зависела от новых технологий, появляющихся в генетике мыши. Что касается lgf2r было использовано позиционное клонирование [positional cloning], чтобы идентифицировать гены, которые картировались в делеции Hairpin-tail на хромосоме 17, и мыши, унаследовавшие эту делецию от одного родителя, были использованы для идентификации генов, обнаруживающих матерински-специфичную экспрессию ( рис. 19.1 ). Что касается Igf2, физиологическую роль этого ростового фактора в эмбриональном развитии тестировали методом инсерционного мутагенеза. Удивительно, что мыши, несущие мутантную нефункциональную аллель, демонстрировали характерный фенотип после передачи от отца, но не обнаруживали его после передачи от матери. В свете ранее полученных данных о том, что нуклеотидные последовательности чужеродной ДНК могут индуцировать импринтированную экспрессию мышиных генов, отцовски- специфичную экспрессию Igf2 с немодифицированных хромосом дикого типа удалось подтвердить также, используя мышей, несущих реципрокные родительские дупликации и нехватки в хромосоме 7 ( рис. 19.1 ). ncRNA H19 была идентифицирована как импринтированный ген в ходе проверки гипотезы о том, что импринтированные гены могут быть собраны в кластеры, после того как этот ген был картирован вблизи локуса Igf2 на хромосоме 7. Хотя все эти стратегии должны были оказаться полезными в последующих попытках идентифицировать импринтированные гены, демонстрация того, что импринтированные гены собраны в плотные кластеры, оказалась центральным открытием для нашего понимания механизма, контролирующего геномный импринтинг у млекопитающих.
