Модификации хроматина инфузорий коррелируют с состояниями активности

Ацетилирование . Гиперацетилирование гистонов в макронуклеусе и отсутствие этой модификации в микронуклеусе дали новые данные, позволяющие связать эту посттрансляционную модификацию с активацией генов ( Vavra et al., 1982 ). Ферменты, осуществляющие ацетилирование гистонов у любого организма, оставались неизвестными до середины 1990-х годов, когда С. Дэвид Аллис и его сотрудники очистили первую гистоновую ацетилтрансферазу ( HAT ) типа A (ядерную) ( Brownell and Allis, 1995 ; Brownell et al., 1996 ). Эти исследователи начали с высокоочищенных макронуклеусов для того, чтобы отделить эту активность от активности цитоплазматической HAT типа В, и продолжили очистку с помощью тестирования в геле (in-gel assay). Для этого метода очищенные гистоны были заполимеризованы в полиакриламидную матрицу геля, используемого для разделения фракций очищенных белков. После электрофореза эти белки были ренатурированы и проинкубированы с ацетил-СоA, несущим радиоактивную метку, для того чтобы выявить полипептид с кажущейся молекулярной массой 55 kD, который мог бы включить эту метку в гистоновый матрикс.

Действительный прорыв произошел после микросеквенирования этого очищенного белка и клонирования гена. Эта HAT, выделенная из Tetrahymena , оказалась гомологичной хорошо охарактеризованному регулятору транскрипции пекарских дрожжей - белку Gcn5 . До этого открытия думали, что активаторы транскрипции в основном действуют, рекрутируя РНК-полимеразу к промоторам, но эта работа показала, что активаторы транскрипции могут также обладать ферментативной активностью, модифицируя хроматин или другие регуляторы транскрипции и меняя таким образом состояние матрицы. Дверь была открыта, и вскоре после этого было показано, что многие известные регуляторы действуют как HATs.

Метилирование . Ядерный диморфизм инфузорий еще раз доказал свои преимущества в выяснении роли метилирования гистонов. Эта модификация у растущих клеток Tetrahymena ограничена макронуклеусами ( рис. 7.4 ). Активность метилтрансферазы лизина гистонов ( НКМТ ), очищенная из этих ядер, специфически модифицировала гистон 3 по лизину 4 ( НЗК4me ), установив тем самым одну из первых корреляций между этой специфической модификацией и транскрипционной активностью ( Strahl et al., 1999 ).

Метилирование гистона НЗ по лизину 9 у вегетативно размножающихся клеток отсутствует, но специфически происходит во время развития макронуклеусов на ограниченных зародышевой линией последовательностях, которые элиминируются из соматического генома ( Taverna et al., 2002 ). Регулируемое развитием установление H3K9me2 (диметилирование) на этих специфических последовательностях дает нам полезную модель для выяснения нацеливания этой модификации на эквивалент гетерохроматина (в деталях описывается ниже).

Фосфорилирование . Очистка меченных Р32 гистонов из микро- и макронуклеусов показала, что , H2A и линкерные гистоны сильно фосфорилированы ( Allis and Gorovsky, 1981 ). Фосфорилированы множественные сайты макронуклеарного H1 , и эта модификация, как было показано, участвует в регулировании транскрипции специфических генов ( Mizzen et al., 1999 ). С помощью мутационного анализа Доу и Горовски [Dou and Gorovsky] обнаружили, что эту потребность в фосфорилировании можно было имитировать добавлением в H1 заряженых аминокислот ( Dou et al., 1999 ). Однако эти заряженные остатки не обязательно должны находиться в соответствующих позициях фосфорилированной аминокислоты; для комплементарного эффекта требуется наличие кластера заряженных сайтов ( Dou and Gorovsky, 2000 , Dou and Gorovsky, 2002 ). Эти исследования показали, что само по себе фосфорилирование не требовалось, но что соответствующая транскрипция стимулировалась критической плотностью зарядов.

В гистоне НЗ фосфорилирована единственная позиция, серин 10 (H3S10ph) ( Wei et al., 1998 ). Эта модификация зависит от клеточного цикла и коррелирует с митозом у многих эукариот. У Tetrahymena в ходе митоза и мейоза она ограничена микронуклеусами . Замещение нормального гена гистона НЗ мутантной формой, содержащей замену серина 10 аланином (S10A), вызывает дефекты в делении микронуклеуса, результатом чего оказывается отставание хромосом и анэуплоидия ( Wei et al., 1999 ). Однако амитотическое деление макронуклеуса не затрагивается. Эти результаты демонстрируют, что фосфорилирование НЗ играет важную роль в конденсации и (или) сегрегации хромосом. Уникальный ядерный диморфизм инфузорий опять позволил получить ключевые данные о роли модификаций хроматина.

Ссылки: