Спасение наследуемых макронуклеарных делеций в геноме инфузорий
Экспериментальное "спасение" наследуемых макронуклеарных делеций.
Является ли простое отсутствие некоего геномного района в материнском соматическом макронуклеусе достаточным для направления его будущей элиминации? Если это так, тогда повторное введение гена A в макронуклеус d48 должно было бы "спасать" этот дефект в воспроизведении гена A в ходе развития. Сначала было показано, что инъекция либо макронуклеоплазмы дикого типа в вегетативный макронуклеус d48 ( Harumoto, 1986 ), либо цитоплазмы от автогамных клеток дикого типа в клетки d48 в раннем развития ( Koizumi and Kobayashi, 1989 ) приводили к перманентной реверсии d48 к дикому типу. Впоследствии прямая микроинъекция нескольких неперекрывающихся фрагментов гена A, распространяющихся на большую часть примерно 8-тн кодирующей последовательности, в макронуклеус d48 продемонстрировала, что последовательность гена A сама по себе достаточна для восстановления макронуклеарного перестроечного паттерна дикого типа ( рис. 7.7 ) ( Koizumi and Kobayashi, 1989 ; Jessop-Murray et al., 1991 ; You et al., 1991 ).
Влияние материнского генома на перестройки ДНК показывает заметную специфичность по последовательности. Кодирующие последовательности гена A и гена B в целом идентичны на 74%. Тем не менее, инъекция последовательностей гена A в макронуклеус клеточной линии, несущей макронуклеарные делеции обоих генов, могла лишь предотвращать делецию гена A из нового макронуклеуса; и сходным же образом, инъекция гена В могла лишь препятствовать своей собственной делеции ( Scott et al., 1994 ). Кроме того, макронуклеарную делецию d48 нельзя было "спасти" трансформацией геном G от P. primaureiia , на 78% идентичным с геном A. С другой стороны, макронуклеарная делеция гена A могла быть "спасена" трансформацией другой аллелью гена A, демонстрирующей 97%-ную идентичность ( Forney et al., 1996 ). Таким образом, материнское "спасение" макронуклеарных делеций является зависящим от гомологии процессом, который не нуждается в какой-либо специфической последовательности внутри генов, но требует некоего минимального уровня идентичности последовательностей.
Этот материнский эффект "спасения" d48, на первый взгляд, выглядит как не согласующийся с индуцированными трансгеном делециями, поскольку в этих экспериментах инъекция последовательностей гена A в материнский макронуклеус имела в точности противоположные последовательности в зиготическом гене A. Этот кажущийся парадокс был разрешен, когда было показано, что постзиготический эффект делеций зависит от установления зависящего от гомологии сайленсинга в трансформированных клонах ( Gamier et al., 2004 ). Наоборот, эффект "спасения" наблюдается лишь в условиях трансформации, которые не вызывают сайленсинга (т.е. лишь умеренные числа копий для неэкспрессируемых конструктов или любое число копий для экспрессируемых трансгенов) ( Gamier et al., 2004 ). Таким образом, оказывается, что накопление приблизительно 23-нуклеотидных siRNA может предотвратить эффект "спасения" последовательностей гена A в материнском макронуклеусе, который стимулирует амплификацию гена A в развивающемся макронуклеусе. Это является сильным доводом в пользу того, что цитоплазматическим фактором, опосредующим trans-ядерный эффект, является транскрипт гена A. Однако это не обязательно должна быть полноразмерная mRNA, потому что даже фрагменты кодирующей последовательности обладают, как было показано, "спасающей" активностью. Более того, клоны, содержащие целый ген, часто экспрессируют эту mRNA на протяжении всего вегетативного роста, тогда как продукция "спасающего" цитоплазматического фактора ограничена, как было показано, периодом ядерной реорганизации.
