Хромосомные белки и модификаторы хромосомных белков у Drosophila, II
С использованием этого подхода в разных опытах по скринингу просмотрели более миллиона мух, и были изолированы более 140 мутаций Su(var) и 230 мутаций E(var) ( Schotta et al., 2003 ). Мутации были индуцированы EMS , Х-лучами или ремобилизацией элементов Р . Еще один набор мутаций Su(var) был изолирован в ходе прямого скрининга с wm4 ( Sinclair et al., 1983 ). Скрининг с хромосомой Df(l;f) , демонстрирующей сильный мозаицизм по гену yellow (маркер, желтая окраска тела), привел к изоляции 70 мутаций-модификаторов PEV ( Donaldson et al., 2002 ). Кроме того, скрининг на доминантные модификаторы экспрессии транспозонного репортерного гена позволил идентифицировать несколько мутаций с эффектом Su(var) ( Birchler et al., 1994 ). Известно, что выборка критических регуляторных генов даун - регулируется генами группы Polycomb ( PcG ) и an - регулируется генами группы trithorax ( trxG ). В прямых тестах относительно немногие мутации в генах PcG модифицируют PEV (например, Sinclair et al., 1998 ). Напротив, многие мутации в генах trxG являются энхансерами PEV ( Dorn et al., 1993а ; Farkas et al., 1994 ).
В совокупности этот скрининг позволил идентифицировать большое число доминантных мутаций Su(var) и E(var). По данным выполненного к настоящему времени генетического анализа общее число мутаций Su(var) и E(var) можно оценить как приблизительно 150. Большое число генов Su(var) и E(var) с почти идентичными фенотипическими эффектами иногда приводит к несоответствиям в генетической номенклатуре. Чаще всего символы генов Su(var) и E(var) комбинируются с цифрами, указывающими хромосому, в которой локализована данная мутация, с номером гена и номером аллели. Так, Su(var)3-9(17) символизирует аллель 17 девятого гена Su(var), идентифицированного в третьей хромосоме. В настоящее время были тщательно картированы лишь около 30 соответствующих генов и идентифицированы соответствующие аллели ( табл. 5.1 ). Зависящие от дозы эффекты наблюдались для примерно одной трети идентифицированных генов, с использованием серии перекрывающихся нехваток и дупликаций. В этих случаях уменьшение количества генных продуктов из-за утери одной копии гена неизменно приводит к модификации мозаичного фенотипа. Делеции этих локусов Su(var) или E(var) супрессируют или, соответственно, усиливают сайленсинг генов. Исследования с использованием дупликаций позволили идентифицировать новые локусы-модификаторы, которые обнаруживают противоположное (антиподное) влияние на PEV, если путем дупликации или с помощью инсерции трансгена вводится лишняя копия данного гена. Общее число генов-модификаторов PEV, обнаруживающих зависящие от дозы эффекты, оценивается примерно в 15-20 ( Schotta et al., 2003 ).
Если утрата одной копии гена приводит к супрессии PEV , а присутствие трех копий гена ведет к усилению PEV, это позволяет предполагать, что для установления гетерохроматина требуется, в стоихиометрических количествах, продукт, кодируемый этим геном, с сопутствующим сайленсингом гена ( рис. 5.2 ). Были детально охарактеризованы три таких локуса, Su(var)2-5 (кодирующий НР1 ), Su(var)3-7 (кодирующий белок типа "цинковых пальцев") и Su(var)3-9 (кодирующий метилтрансферазу лизина гистонов). Su(var)2-5 был клонирован путем скрининга библиотеки экспрессии кДНК с помощью моноклонального антитела, распознающего гетерохроматин ( James and Elgin, 1986 ). Кодируемый белок, ассоциированный с гетерохроматином, был впоследствии обозначен НР1 (белок гетерохроматина 1). Гибридизация in situ с использованием выделенной клонированной ДНК позволила идентифицировать ген в районе 28-29 политенных хромосом, где ранее был картирован Su(var)2-5. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК мутантных аллелей подтвердил, что локус Su(var)2-5 в положении 28F1-2 на хромосоме кодирует НР1 ( Eissenberg et al., 1990 ). НР1 содержит два консервативных домена, аминотерминальный хромодомен и карбокситерминальный домен "chromoshadow" (Paro and Hogness, 1991), и взаимодействует с несколькими другими хромосомными белками. Su(var)3-7 был сперва цитогенетически картирован (с помощью серии перекрывающихся делеций и дупликаций) в районе 87Е1-4 в третьей хромосоме. Этот район был проанализирован на уровне ДНК как часть первой "прогулки по хромосоме" [chromosomal walk], выполненной у Drosophila ( Bender et al., 1983 ). С помощью серии перекрывающихся геномных клонов Su(var)3-7 был определен в пределах фрагмента ДНК величиной 7.8 т.о., который обладал трипло-энхансерным влиянием на репортер, обнаруживающий мозаичность ( Reuter et al., 1990 ). Su(var)3-7 кодирует белок с семью регулярно расположенными [regularly spaced] "цинковыми пальцами" - доменами, которые, как было показано, функционируют в связывании с ДНК ( Cleard and Spierer, 2001 ). Su(var)3-9 был клонирован с помощью таггирования транспозоном P-элементом ( Tschiersch et al., 1994 ). Ген Su(var)3-9 у Drosophila (и у всех других голометаболических насекомых , изученных к настоящему времени) образует бицистронную единицу с геном, кодирующим eIF2y ( Krauss and Reuter, 2000 ). Поскольку транскрипционная единица Su(var)3-9 не имеет интронов, вполне вероятно, что Su(var)3-9 был вставлен в интрон гена eIF2y путем ретротранспозиции. Белок SU(VAR)3-9 содержит хромодомен в своем аминотерминальном участке и домен SET (идентифицированный впервые в белках SU(VAR)3-9, enhancer of zeste [E(Z)] и TRITHORAX) ( Jones and Gelbart, 1993 ; Tschiersch et al., 1994 ) на своем карбоксильном конце. Этот белок является метилтрансферазой гистонов, специфически модифицирующей гистон НЗ по лизину 9.
Были описаны семь разных мутантных аллелей Su(var)2-5, в том числе миссенс-мутации в хромодомене, преждевременные стоп-кодоны и ошибки сплайсинга ( Eisenberg et al., 1992 ). Мутации Su(var)3-7 были получены с помощью гомологичной рекомбинации ( Seum et al., 2002 ); дополнительные аллели были выявлены как супрессоры сайленсинга, зависимого от Р-элемента ( Bushеу and Locke, 2004 ). Сорок мутантных аллелей Su(var)3-9 были выявлены и определены на молекулярном уровне ( Ebert et al., 2004 ). Иммуноцитологический анализ с использованием специфических антител или химерных белков слияния, экспрессируемых трансгеном [transgene- expressed fusion proteins], показал, что все три белка преимущественно ассоциированы с гетерохроматином (см. ниже и рис. 5.4 ) ( James et al., 1989 ; Cleard et al., 1997 ; Schotta et al., 2002 ). Сильная колокализация особенно очевидна для НР1 и SU(VAR)3-9. Эти белки также связываются с теломерами и в ряде эухроматиновых сайтов ( Fanti et al., 1998 ; Schotta et al., 2002 ).
Несколько инсерций Р-элемента, несущих репортерный ген w+ в теломерные районы, обнаруживают белую пятнистость. Этот феномен называется теломерным эффектом положения (ТРЕ) . Упаковка, подобная гетерохроматину, наблюдается в ассоциированных с теломерами сателлитных последовательностях ( TAS ), кластерах повторяющейся ДНК, расположенных проксимально по отношению к ретровирусным элементам HeT-A и TART , составляющим теломеры Drosophila ( Cryderman et al., 1999a ). В целом, не было обнаружено модификации ТРЕ мутациями в известных генах- модификаторах, хотя НР1 важен для целостности теломер. В клетках с недостаточностью по этому белку хромосомы часто сливаются в области своих теломер ( Fanti et al., 1998 ). У Drosophila в ходе недавнего скрининга не было обнаружено никаких trans-действующих доминантных модификаторов ТРЕ ( Mason et al., 2004 ), что заставляет предполагать, что эти участки сайленсированы двумя (или несколькими) независимыми механизмами.
