Коллагенозы: возможности генной терапии
Проведены предварительные эксперименты для выяснения возможностей генной терапии либо для управления отложением коллагена в условиях фиброза , либо для спасения фенотипов мутантных генов. Как указано выше, олигонуклеотиды частично ингибировали экспрессию генов коллагенов в экспериментах с культурами клеток [ Colige ea 1991 , Laptev ea 1994 , Marini ea 1994 ]. С помощью аналогичного подхода было показано, что антисенс-ген для человеческого гена COL1A1 оказывает эффективное воздействие у трансгенных мышей [ Khillan ea 1994 ].
Проведены эксперименты на мышах, обладающих летальным фенотипом хрупких костей ввиду экспрессии ими мини-гена цепи проальфа1(I) человеческого проколлагена с внутренней делецией. Мыши были скрещены с трансгенными мышами, экспрессировавшими антисенс-ген , сходный с обладающим внутренней делецией мини-геном человека COL1A1, но с инвертированной в соответствии с кодом гибридной сенс- и антисенс-РНК половиной, прилегающей к 3'-концу гена. У мышей, унаследовавших оба гена, вероятность возникновения летального фенотипа хрупких костей была сокращена с 92 до 27% [ Khillan ea 1994 ], причем этому соответствовало снижение уровня содержания цепей мини-проальфа1(I) человека в тканях. Возможно, эксперимент оказался успешным, несмотря на неудачу предыдущих экспериментов с антисенс-кДНК, поскольку транскрипт антисенс-гена содержал инвертированные интронные последовательности и, следовательно, взаимодействовал с ядерным сенс-транскриптом.
В сходных экспериментах нормальные мыши были подвергнуты воздействию летальной дозы радиации, после чего были получены клетки стромы костного мозга трансгенной мыши, содержащие маркер ДНК, представляющий собою мини-ген COL1A1. По истечении пяти месяцев было обнаружено, что донорные клетки составляли 3-5% клеток костного мозга, селезенки, кости, хряща и легких [ Pereira ea 1995 ].
Человеческий мини-ген COL1A1 экспрессировался также в кости. Поскольку клетки стромы костного мозга легко размножаются в клеточной культуре, они могут являться полезным источником долгоживущих клеток-предшественников для генной терапии заболеваний кости и хряща.
Разработаны также технологии сайт-направленной инсерции экзогенного коллагенового гена во внутренний генный локус [ Ganguly ea 1994 ]. В экспериментах по трансфекции с линией опухолевых клеток человека, известной как HT-1080 , было обнаружено, что содержащая короткий 5'- концевой фрагмент гена COL1A1 конструкция, соединенная с 30-ю килобазами гена COL2A1, с высокой частотой внедрялась в обе аллели гена COL1A1 [ Ganguly ea 1994 ].
В трансфецированных клетках с направленной инсерцией наблюдался высокий уровень экспрессии экзогенного гена. Результаты предполагают возможность направленного внедрения генов в предварительно определенные генные локусы коллагенов. Направленная инсерция обладает тем преимуществом, что она обеспечивает управление экспрессией внедренных генов, а также дает возможность избежать возможных опасностей случайных инсерций.
