oriC: этапы инициации синтеза ДНК
Сборка исходного комплекса начинается с взаимодействия белка DnaA с DnaA-боксами R1-R4 и M ( рис. I.47,б ). Для прохождения последующих этапов сборки реплисомы белок DnaA должен находиться в комплексе с ATP и взаимодействовать с сверхспирализованным oriC. С помощью электронного микроскопа исходный комплекс обнаруживается в виде компактной эллипсоидной структуры, содержащей около 20 мономеров DnaA, которая закрывает oriC. Исходный комплекс обладает высокоупорядоченной структурой.
В присутствии ATP в высокой концентрации (5 мМ) исходный комплекс превращается в открытый комплекс . В этом комплексе происходит частичное расплетение АТ-богатых 13-нуклеотидных повторов, расположенных в левой части oriC. При 37* или выше единственный белок DnaA может обеспечивать расплетение ДНК. Для образования открытого комплекса при более низких температурах требуется участие структурирующего белка HU или интеграционного фактора бактерии-хозяина IHF . В открытом комплексе обнаруживают небольшие участки расплетенной ДНК в правой части oriC между DnaA-боксами R2 и R4, которые рассматривают как места посадки хеликазы.
Белок DnaB является хеликазой репликативной вилки и входит в открытый комплекс с образованием препраймирующего комплекса I , взаимодействуя с одноцепочечными участками частично расплетенной ДНК. Такие участки подготавливаются белком DnaA, который вытесняет SSB-белок с соответствующих сайтов. DnaB входит в препраймирующий комплекс I в виде гексамеров, образовавших комплекс с шестью мономерами DnaC , каждый из которых связывает одну молекулу ATP. В этом комплексе хеликазная активность белка DnaB блокирована. Освобождение DnaC из комплекса происходит в результате гидролиза ATP. Следствием этого является активация хеликазы DnaB и ее правильное расположение в комплексе. Совокупность этих событий превращает препраймирующий комплекс I в препраймирующий комплекс II .
Хеликаза должна начать функционировать в месте старта репликативной вилки в правой части oriC вблизи DnaA-боксов R2, R3 и R4. Для этого она должна быть транслоцирована от места ее первоначального вхождения в комплекс к точке начала репликации. Предполагается, что транслокация ассоциирована с ATP-зависимым освобождением из комплекса белка DnaC, что сопровождается активацией хеликазы.
В праймирующем комплексе хеликаза DnaB взаимодействует с DnaG-праймазой, которая играет ключевую роль в обеспечении инициации репликации именно на oriC. Оба этих фермента обеспечивают сопряжение функционирования двух репликативных вилок, движущихся в противоположные стороны. В бесклеточной системе при низких концентрациях праймазы репликация становится однонаправленной и может инициироваться не на oriC. В праймирующем комплексе присутствие белка DnaA больше не требуется, и он после освобождения из комплекса может быть повторно использован для инициации репликации на другом oriC. Полагают, что во время координированной сборки двух репликативных вилок в одной из них синтезируется праймер, который становится затравкой при синтезе ведущей цепи другой репликативной вилкой, движущейся в противоположном направлении. Праймаза в праймирующем комплексе функционирует по дистрибутивному механизму. После синтеза праймеров она покидает репликативную вилку и заменяется новой молекулой праймазы во время образования очередного фрагмента Оказаки .
При образовании реплисомы в каждой репликативной вилке происходит ATP-зависимое формирование димерного комплекса холофермента ДНК-полимеразы III, связанного с 3'-концами праймеров (скользящий зажим). Вслед за этим происходит координированная элонгация праймеров, сопровождаемая двунаправленным синтезом ведущих и отстающих цепей ДНК. В бесклеточной системе точки начала синтеза ведущих цепей локализованы в oriC вблизи DnaA-боксов R2, R3 и R4.
