Генная инженерия: методы: общие сведения
Методами генной инженерии получены данные о структуре и функционировании генов разнообразных организмов, что дало возможность перейти на качественно новый уровень генетических исследований. Это, во-первых, возможность переноса гена в новое для него генетическое окружение с дальнейшей его экспрессией, что ведет к изменению свойств организма, в геном которого вводится ген (например, создание продуцентов биологически активных веществ или трансгенных организмов ), а также осуществление генотерапии наследственных и приобретенных заболеваний путем искусственного замещения мутантных аллелей. Во-вторых, стало реальным конструирование новых генов путем объединения in vitro как известных, так и новых, искусственно синтезированных последовательностей нуклеотидов. Этот подход используется в белковой инженерии для исследования функциональной значимости отдельных аминокислот и доменов в полипептидных цепях ферментов, а также для создания новых белков. В-третьих, в биотехнологии появилась возможность применять изолированные гены в составе генно-инженерных конструкций для получения пищевых продуктов и биологически активных веществ белковой природы.
Для получения необходимого числа копий гена используют метод молекулярного клонирования . Сущность метода заключается в том, что нуклеотидная последовательность, которую необходимо выделить или размножить, ковалентно встраивается в самореплицирующиеся молекулы нуклеиновой кислоты, называемые векторами . Далее такая последовательность нуклеотидов в составе вектора вводится в клетки про- или эукариотического организма, и эти гибридные клетки в селективных условиях, обеспечивающих сохранение вектора внутри клеток, выращивают на питательной среде. В результате образуется клон клеток, теоретически содержащих идентичные векторные молекулы с одной и той же вставкой чужеродной последовательности нуклеотидов. Объединение молекул клонируемой последовательности нуклеотидов и вектора является рекомбинацией in vitro, поэтому такие гибридные молекулы называют рекомбинантными молекулами . Разработаны методы, позволяющие выделять определенные последовательности нуклеотидов из сложной смеси фрагментов хромосомной ДНК, а также осуществлять обмен между строго определенными фрагментами генов и другими последовательностями нуклеиновых кислот.
Большинство ферментов, применяемых для молекулярного клонирования нуклеиновых кислот, участвует в метаболизме нуклеиновых кислот in vivo. Процесс клонирования и исследования клонированных последовательностей нуклеотидов сводится к проведению in vitro ферментативных реакций с использованием очищенных ферментов и их субстратов - нуклеиновых кислот.
Различия в методах очистки ДНК и РНК определяются большей чувствительностью молекул РНК к гидролитическому расщеплению из- за присутствия у рибонуклеотидов свободных 2'-ОН групп, низкой молекулярной массой и компактной пространственной структуры. Для выделения нуклеиновых кислот в нативном состоянии необходимо использовать мягкие условия разрушения тканей биологического объекта и инактивировать гидролитические ферменты (ДНКазы или РНКазы) до того, как они успеют гидролизовать молекулы нуклеиновых кислот. Ингибиторы нуклеаз вводятся в буферные растворы до разрушения клеток или тканей. В качестве ингибиторов нуклеаз используют как неспецифические денатурирующие агенты (ионные детергенты, гидроокись ртути , гуанидинхлорид , гуанидинизотиоцианат , фенол , хлороформ и т.п.), так и специфические ингибиторы, например, ингибитор РНКазы из плаценты человека или ванадиевые комплексы рибонуклеозидов.
Работу двухцепочечной геномной ДНК усложняют значительная молекулярная масса и высокая жесткость выделяемых молекул. Следствием этого являются большая вязкость растворов высокомолекулярной ДНК и легкость ее фрагментации в растворах. При выделении ДНК допускается лишь мягкое перемешивание ее раствора в процессе депротеинизации. На первых этапах очистки применяют протеолитические ферменты ( протеиназу К из Trirachium album или проназу из Streptomyces griseus), фенол и хлороформ. Поскольку при освобождении от белков происходит одновременная очистка ДНК и РНК, для освобождения от примесей РНК применяют высокоочищенные препараты РНКаз без примесей ДНКаз (чаще всего панкреатическую РНКазу), а в случае выделения РНК - ДНКаз, не загрязненных РНКазами.
