Методы молекулярного клонирования
Для получения необходимого числа копий гена используют методы молекулярного клонирования. Сущность метода заключается в том, что нуклеотидная последовательность, которую необходимо выделить или размножить, ковалентно встраивается в самореплицирующиеся молекулы нуклеиновой кислоты, называемые векторами . Далее такая последовательность нуклеотидов в составе вектора вводится в клетки про- или эукариотического организма, и эти гибридные клетки в селективных условиях, обеспечивающих сохранение вектора внутри клеток, выращивают на питательной среде. В результате образуется клон клеток, теоретически содержащих идентичные векторные молекулы с одной и той же вставкой чужеродной последовательности нуклеотидов. Объединение молекул клонируемой последовательности нуклеотидов и вектора является рекомбинацией in vitro, поэтому такие гибридные молекулы называют рекомбинантными молекулами . Разработаны методы, позволяющие выделять определенные последовательности нуклеотидов из сложной смеси фрагментов хромосомной ДНК, а также осуществлять обмен между строго определенными фрагментами генов и другими последовательностями нуклеиновых кислот.
Большинство ферментов, применяемых для молекулярного клонирования нуклеиновых кислот, участвует в метаболизме нуклеиновых кислот in vivo. Процесс клонирования и исследования клонированных последовательностей нуклеотидов сводится к проведению in vitro ферментативных реакций с использованием очищенных ферментов и их субстратов - нуклеиновых кислот.
Генная инженерия: методы: общие сведения
