Плазмиды и их эволюция: общие сведения
Плазмида (plasmid): способный к автономной (независимой от основной хромосомы) репликации внехромосомный генетический элемент, существующий у многих видов бактерий, обычно дающий преимущество клетке-хозяину (например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.п.). Это линейные или кольцевые ковалентно замкнутые молекулы ДНК, содержащие от 1500 до 40000 пар нуклеотидов. Для них характерно стабильное существование и наследование в бактериях в ряду клеточных поколений. Используются в качестве векторов для клонированияя.
Размеры плазмид варьируют от нескольких тысяч до сотен тысяч пар оснований, а число копий на клетку - от одной до нескольких сотен . Хотя многие плазмиды дают клеткам-хозяевам ощутимые селективные преимущества, большинство из них являются криптическими , т.е. не проявляющимися в фенотипе клеток.
Область начала репликации небольшой плазмиды ColE1 , несущей гены устойчивости к колицинам , традиционно используется в генной инженерии при конструировании векторных молекул ДНК, которые находят применение для клонирования и экспрессии в клетках E. coli коротких последовательностей нуклеотидов.
Плазмиды обнаружены у многих бактерий, принадлежащих к разным таксономическим группам. Количество плазмидной ДНК в клетке составляет обычно не более нескольких процентов от клеточного генома, а число плазмид колеблется от 1 до 38. Большинство плазмид состоит из трех групп генов: участка ДНК, ответственного за автономную репликацию плазмиды в клетке; системы генов, обеспечивающих возможность переноса плазмид из одной клетки в другую; генов, определяющих свойства, полезные для клетки-хозяина. Отличительная особенность плазмид - способность к автономной репликации, поэтому минимальное количество ДНК, которое может быть названо плазмидой, - это фрагмент, обеспечивающий автономную репликацию плазмидной ДНК в клетке как единого целого.
Обычно о присутствии плазмид в бактериальной клетке судят по проявлению определенных признаков, к которым относится устойчивость к отдельным лекарственным препаратам, способность к переносу генов при конъюгации , синтез веществ антибиотической природы, способность использовать некоторые сахара или обеспечивать деградацию ряда веществ.
Из перечисленного выше видно, что плазмиды делают возможным существование организмов в более широком диапазоне условий внешней среды, т.е. действуют как факторы адаптации. Большую группу составляют плазмиды с нерасшифрованными функциями; такие плазмиды выявляют с использованием физико-химических методов.
Большинство бактериальных плазмид имеет фактор несовместимости и фактор переноса. Они несут множество специальных, детерминируемых каждой отдельной плазмидой маркеров, таких как устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, ультрафиолетовому облучению, способность к биосинтезу токсинов.
Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, т. е. содержащих чужеродный ген, плазмид. Каждая бактерия помимо основной, не покидающей клетку молекулы ДНК (5-6 млн. пар нуклеотидов), может содержать, как уже было сказано, несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями. Плазмиды реплицируются в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости . Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам.
Большая часть таких препаратов - антибиотиков используется в качестве лекарств при лечении ряда заболеваний человека и домашних животных. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к различным антибиотикам, к солям тяжелых металлов. При действии определенного антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им жизнь. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они входят и выходят из бактерий, используются генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов.
Мощным инструментом генной инженерии являются открытые в 1974 г. ферменты - рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы . Рестрикция буквально означает ограничение. Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной, в первую очередь фаговой ДНК, что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы узнают определенные последовательности нуклеотидов (так называемые сайты - участки узнавания) и вносят симметричные, расположенные наискось друг от друга, разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра сайта узнавания. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные "хвосты", называемые липкими концами ( рис. 52 ). Из разных видов бактерий выделено около 200 различных рестриктаз, для которых описаны сайты рестрикции.
В 60-70 годы прошлого века накопилось множество фактов, свидетельствующих о роли плазмид, преимущественно крупных, в процессе быстрого распространения в клинике устойчивых штаммов бактерий. И тогда закономерно встал вопрос о происхождении этих плазмид: присутствовали ли они в клетках патогенных бактерий изначально (до применения антибиотиков), а затем просто произошло увеличение их численности, или же они сформировались в условиях интенсивного использования различных антибиотиков.
Для ответа на этот вопрос повторно исследовали штаммы энтеробактерий из коллекции Муррея, выделенные в годы, предшествующие открытию и применению антибиотиков. Оказалось, что большинство исследованных штаммов содержат конъюгативные плазмиды, причем тех же групп несовместимости, что и современные штаммы, но, в отличие от последних, гены антибиотикоустойчивости в них отсутствуют [ Hughes, 1983 , Datta, 1983 ]. Поэтому был сделан однозначный вывод, что начало процесса возникновения плазмид с генами лекарственной устойчивости следует приурочить к первым годам использования антибиотиков в медицинской практике.
Многочисленные исследования, выполненные в лабораториях различных стран в последующие годы, показали, что формирование плазмид, несущих гены множественной лекарственной устойчивости, происходило путем внедрения в их ДНК различных мобильных элементов, преимущественно транспозонов и интегронов . В ряде случаев удалось проследить этапы этого процесса во времени. Так, в результате ретроспективного анализа структуры конъюгативных плазмид Salmonella enterica Typhimurium было установлено, что формирование и повсеместное распространение штаммов салмонелл, характеризующихся множественной лекарственной устойчивостью, произошло в результате нескольких последовательных актов встраивания интегронов, несущих различные наборы генов устойчивости, в геном этих плазмид [ Carattoli, 2001 ].
В дальнейшем неоднократно наблюдалось, как по мере внедрения в медицинскую практику новых антибиотиков неизменно появлялись плазмиды, содержащие интегроны с генами, обеспечивающими устойчивость бактерий к этим антибиотикам. В плазмидах "современных" штаммов бактерий обычно обнаруживают интегроны, содержащие длинные цепочки генов устойчивости, иногда - до 9 генов [ Naas, 2001 ].
В настоящее время, благодаря использованию современных методов молекулярной биологии, удалось полностью расшифровать молекулярно- генетическую структуру многих сложных плазмид, обнаруженных в устойчивых штаммах бактерий. Типичными примерами плазмид, демонстрирующих сложную мозаичную структуру и выделенных из различных источников сравнительно недавно, являются плазмида pTP10 и плазмида pRSB107 .
