ДНК-типирование: с использованием коротких праймеров
Использование коротких олигонуклеотидных праймеров произвольной структуры основано на том, что в больших геномах для них имеются множественные сайты посадки, а следовательно, и инициации ПЦР . Чем короче такие праймеры, тем большее количество сайтов посадки для них должно существовать. Одним из ограничений дальнейшего участия таких праймеров в ПЦР будет расстояние между двумя сайтами посадки для противоположно направленных праймеров. Чем длиннее ПЦР-продукт, который должен образовываться в результате функционирования таких праймеров, тем менее надежно работает вся система типирования.
На практике длина образующихся с произвольными праймерами продуктов ПЦР находится в пределах 0,2-2,0 т.п.о. В зависимости от локализации на ДНК мест посадки для пары коротких праймеров могут образовываться два типа продуктов ПЦР.
В первом случае различия в длинах продуктов ПЦР обусловлены присутствием на ДНК типируемых микроорганизмов разного числа сайтов связывания для одного или обоих праймеров ( рис. II.35,а ).
Во втором случае такие различия определяются длинами сегментов ДНК ( ампликонов ), заключенных между парами мест посадки праймеров при неизменном их числе в конкретных генетических локусах (см. рис. II.35,б ). На практике могут одновременно реализовываться обе эти возможности.
Во время генетического типирования эукариот иногда сразу функционируют до 100 ампликонов, у бактерий - около 20. Несмотря на то, что последовательности праймеров выбираются произвольно, получаемая картина амплификации является видо- и штаммоспецифичной. При этом количество сайтов связывания на одной и той же ДНК для праймеров одинаковой длины, но с разной первичной структурой может существенно варьировать.
На рис. II.35 показаны свойства двадцати 10-нуклеотидных праймеров, испытанных на ДНК человека, бобов и S. aureus. Видно, что использование праймера AGGGGTCTTG, например, приводит к амплификации 8 ампликонов в ДНК человека, 3 ампликонов в ДНК соевых бобов и не выявляет ни одного ампликона в ДНК S. aureus, тогда как при использовании праймера AATCGGGCTG удается обнаруживать до 40 ампликонов в ДНК человека и соевых бобов и до 20 ампликонов в бактериальной ДНК.
