Клетки африканской зеленой мартышки (линия COS)
Получение временной экспрессии генов в клетках COS используется для быстрой наработки рекомбинантных белков и ДНК. При конструировании клеток COS клетки зеленой мартышки CV-1 были трансформированы вирусом SV40 с дефектной областью начала репликации. В результате были получены три линии клеток (COS-1 , COS-2 и COS-7 ), конститутивно экспрессирующих большой T-антиген вируса. После проведения трансфекции клеток экспрессирующими плазмидами, содержащими область начала репликации вируса SV40, последняя эффективно взаимодействует с эндогенным T-антигеном, что сопровождается внехромосомной репликацией плазмиды с образованием большого числа ее копий в цитоплазме клеток. Если рекомбинантный ген в такой плазмиде находится под контролем подходящего промотора, то это приводит к внутриклеточному образованию рекомбинантных белков в больших количествах.
Число копий плазмид, введенных в клетки COS, достигает максимума примерно через 48 ч после трансфекции. Далее внутриклеточный уровень плазмидной ДНК начинает постепенно снижаться из-за ее цитопатического действия и гибели клеток. Поэтому системы, основанные на клетках COS, не могут использоваться для крупномасштабной наработки рекомбинантных белков в течение длительного промежутка времени. Максимальное внутриклеточное содержание рекомбинантных белков в этих системах наблюдают через 72 ч после трансфекции, и их синтез продолжается в течение последующих 5-10 дней на фоне медленного снижения количества клеток в культуре, что позволяет все же использовать клетки COS для препаративного синтеза рекомбинантных белков. С этой целью трансфекции одновременно подвергают до 108 клеток с последующим их выращиванием на роллерах или микроносителях, сопровождаемым многократным сбором культуральной жидкости, что позволяет получать до нескольких миллиграммов рекомбинантного белка из такого пула трансфецированных клеток.
Эффективность системы экспрессии, основанной на клетках COS, зависит от природы рекомбинантного белка, которая определяет его чувствительность к внутриклеточным протеиназам, а также метода трансфекции, соотношения числа клеток и молекул рекомбинантных плазмид, используемых для трансфекции, и состава питательной среды. Пример экспрессирующей кассеты генов, используемой в этой системе, представлен на рис. II.13,а . Такой фрагмент ДНК может быть интегрирован в подходящую коммерческую плазмиду, например, в экспрессирующий вектор pXMT3 .
