Системы экспрессии рекомбинантных генов: общие сведения
Выделение нового рекомбинантного гена заканчивается попытками получения его полноценной экспрессии в искусственных генетических системах. Экспрессия эукариотических генов в бактериях происходит неэффективно из-за образования телец включения и отсутствия необходимых посттрансляционных модификаций рекомбинантных полипептидных цепей. Поэтому используются культивируемые клетки животных и растений, в геном которых рекомбинантные гены вводятся с помощью трансфекции .
Эффективный синтез рекомбинантных белков зависит не только от используемых клеточных линий, но и от конструкции экспрессирующего вектора, и от метода введения рекомбинантных ДНК в эукариотические клетки. Для повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов, стабильно интегрированных в геном культивируемых клеток, разработаны методы их селективной амплификации. С использованием одного из таких методов получены мутантные сублинии клеток яичников китайских хомячков CHO , в которых амплификация происходит в присутствии селектирующего агента, например, метотрексата . Другие системы амплификации основаны на подавлении экспрессии жизненно важных ферментов, например, глутаминсинтетазы или аденозиндезаминазы, под действием специфических ингибиторов: метионинсульфоксимина или 2'- дезоксикоформицина соответственно.
Для получения рекомбинантных белков, кроме метода стабильно трансфецированных линий клеток, используют еще два подхода. С целью наработки небольшого количества рекомбинантных белков и контроля функциональной целостности генно-инженерных конструкций применяют временно экспрессирующиеся векторы, которые обладают способностью к репликации в культивируемых клетках COS во внехромосомном состоянии. В этом случае источником рекомбинантных белков являются супернатанты клеток. При другом подходе рекомбинантные белки синтезируют в культивируемых клетках насекомых после их заражения векторами на основе генома бакуловирусов . Последний подход допускает стабильную экспрессию многих рекомбинантных генов, продукты которых могут находиться как внутри клеток, так и в ассоциированном с поверхностью клеток состоянии, или они могут секретироваться в культуральную жидкость.
Швейцарскими исследователями (С. Гайссе с соавт., 1996 г.) было проведено сравнительное изучение эффективности экспрессии гена цитокина человека - фактора, ингибирующего лейкозы ( huLIF - leukemia inhibitory factor ) в разных эукариотических системах. Фактор huLIF представляет собой белок среднего размера, полипептидная цепь которого содержит несколько потенциальных сайтов N-гликозилирования и в процессе фолдинга образует три дисульфидные связи.
