Клонотеки генов: методы скрининга
Методы получения из клонотек генов требуемых последовательностей нуклеотидов можно разделить на две группы. В первой группе методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на наличие в них искомых последовательностей нуклеотидов. Во втором случае присутствие этих последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах продуктов экспрессии искомых генов - РНК, белков или ферментативной активности.
Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рассевают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры. Для этого стерильные фильтры накладывают на поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК.
Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках.
После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и прикладывают к рентгеновской пленке. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует положению определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения такого исследования точно идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР . При этом в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот.
Если первичная структура искомого гена неизвестна, то, во- первых, можно очистить небольшое количество белка, кодируемого клонируемым геном, и определить последовательность его нескольких N-концевых аминокислот. На основании этих данных с учетом вырожденности генетического кода и частоты встречаемости аминокислотных остатков у исследуемого организма синтезируют олигонуклеотидные зонды, которые используют для гибридизации in situ. Во-вторых, клонотеку генов или кДНК получают с использованием экспрессирующих векторов. В этом случае, если 5'- концевая часть клонируемого гена будет находиться близко от промотора вектора или его кодирующая часть будет соединена в одной рамке считывания с инициирующим ATG-кодоном, то в бактериальных клетках или фаговых лизатах можно обнаружить появление специфического белкового продукта или ферментативной активности. Если рекомбинантный белок неактивен и представляет собой лишь часть полипептидной цепи нативного фермента, его обнаруживают иммунохимическими методами. В ряде случаев отбор нужных клонов может проводиться с помощью генетических методов с использованием специально сконструированных векторных плазмид.
