Ошибки репликации: методы определения
Генетические методы определения частоты ошибок репликации, возникающих в процессе синтеза ДНК in vitro, бывают двух типов. При одном подходе измеряют частоту прямых мутаций, приводящих к инактивации какого-либо гена, изменение которого легко определить фенотипически. Удобной системой, основанной на таком принципе, является репликативная форма ДНК бактериофага M13mp2 , содержащая часть гена бета-галактозидазы в виде одноцепочечной бреши, застраивающейся испытуемой ДНК-полимеразой в бесклеточной системе. Ошибки синтеза ДНК в этом случае выявляют по потере или уменьшению активности бета-галактозидазы, что не отражается на жизнеспособности бактериофага, который образуется после введения такой ДНК в бактериальные клетки с помощью трансфекции. С применением этого метода обнаруживают до 200 различных замен оснований, а также делеции, мутации со сдвигом рамок считывания и сложные генные перестройки.
При другом подходе измеряют частоту обратных мутаций, восстанавливающих (под действием точковой мутации) последовательность нуклеотидов гена, активность белкового продукта которого была нарушена в результате, например, амбер- мутации. Этот метод позволяет определять мутации, происходящие с частотами 10-6-10-8 на нуклеотид за одну генерацию, однако ограничен возможностью определения мутаций лишь одного конкретного типа.
