ДНК-полимераза эукариот: общие сведения
ДНК-полимеразы (Pol) осуществляют синтез дочерних нитей ДНК при репликации , застраивают поврежденные участки ДНК в ходе репарации и потому играют ключевую роль в процессах репродукции генома и сохранения его интактной структуры.
Хотя биологическая задача всех ДНК- полимераз состоит в катализе синтеза ДНК, и в общих чертах эти ферменты подобны, тем не менее каждый тип ДНК-полимераз имеет свои особенности, связанные с его конкретной биологической функцией и реализуемые через его структуру. Известно большое число ДНК-полимераз, например, для клеток человека идентифицированы ДНК-полимеразы репликативные ( ДНК-полимераза aльфа и ДНК-полимераза эпсилон для синтеза отстающей цепи ДНК в репликативной вилке, ДНК-полимераза дельта - для синтеза опережающей цепи), ДНК-полимераза бета - для репарации повреждений ДНК, ДНК-полимераза гамма - для репликации митохондриальной ДНК и теломераза (специфическая обратная транскриптаза, катализирующая синтез теломерных концов хромосом). Наряду с этими ферментами, в специализированных клетках человека найдены еще клеточные обратные транскриптазы, биологическая роль которых не ясна (известно, что они катализируют образование ретротранспозонов), а также матрично-независимая концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза (TDT) , функции которой, по-видимому, связаны с синтезом антител.
В клетках эукариот имеются, по меньшей мере, шесть различных ДНК-зависимых ДНК-полимераз: альфа , бета , дельта , эпсилон , гамма и дзета , которые выполняют различные функции в синтезе ДНК [ Roberts J.D., Kinkel T.A., 1996 ]. Три полимеразы - альфа , дельта и эпсилон - непосредственно участвуют в репликации хромосомной ДНК ( табл. I.17). Аминокислотные последовательности этих трех ферментов гомологичны друг другу и последовательности продукта гена 43 бактериофага Т4 .
Четырехсубъединичная ДНК-полимераза альфа - единственная среди всех ДНК-полимераз, обладающая ДНК-праймазной активностью. Эукариотическая ДНК-праймаза в отличие от аналогичного белка прокариот образует постоянный комплекс с ДНК-полимеразой альфа, роль которого, по-видимому, ограничивается синтезом праймеров при репликации обеих цепей ДНК.
Точность работы ДНК-полимеразы альфа не высока (ошибки репликации возникают с частотой 10 в степени -4) из-за отсутствия корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активности. Предполагается, что роль этой ДНК-полимеразы заключается в инициировании синтеза ДНК в исходном сайте репликации "ori" и производстве РНК-праймеров длиной в 8-10 н., за чем может последовать и синтез небольшого фрагмента ДНК длиной около 50 н. [ Щербакова П.В. 1997 , Roberts J.D., Kinkel T.A., 1996 , Waga S., Stillman B., 1994 ].
Ферменты альфа и бета-типа обнаружены более 30 лет назад и изучены относительно хорошо. Новый всплеск интереса исследователей к ДНК-полимеразам эукариот на рубеже 90-х годов был связан с открытием ДНК-полимераз дельта и эпсилон.
Точность репликации двухсубъединичной ДНК-полимеразы дельта в комплексе с белком PCNA ( ядерным антигеном пролиферирующих клеток , функциональным гомологом бета-субъединицы Pol III из E. coli) на два порядка выше, чем у Pol альфа за счет наличия у нее 3'-5'-экзонуклеазной активности [ Morrison A., Sugino A., 1994 ].
ДНК-полимераза эпсилон более подробно изучена у дрожжей.
Описаны и другие ДНК-полимеразы, такие как ДНК-полимераза Pol бета, лишенная корректирующей активности, и митохондриальная ДНК-полимераза гамма обладающая такой функцией [ Щербакова П.В. 1997 ].
Белок PCNA и фактор репликации C (RFС) образуют стабильный комплекс с Pol дельта, а в определенных условиях стимулируют и активность Pol эпсилон. Во многих отношениях PCNA и RFС являются функциональными аналогами соответственно бета-белка и белков гамма-комплекса E. coli ( рис. I.46,б ), и их роль в синтезе ведущей и отстающей цепей ДНК вируса SV40 хорошо известна.
Нынешний этап исследований характеризуется широким применением генетических методов для анализа функции ДНК-полимераз в репликации и репарации ДНК, использованием рентгеноструктурного анализа для изучения тонкого строения отдельных ферментов. Значительный интерес проявляется к посттрансляционной модификации ДНК-полимераз, их взаимодействию со вспомогательными факторами в составе репликативных и репаративных ансамблей, а также к проблеме регуляции активности ДНК-полимераз в клеточном цикле.
В последние годы наряду с углубленным изучением строения и свойств отдельных ДНК-полимераз эукариот (в этом направлении наибольший успех достигнут в изучении ДНК-полимеразы бета ) все большее внимание уделяется взаимодействию ДНК-полимераз со вспомогательными факторами и механизму функционирования в составе многокомпонентных репликативных и репаративных комплексов. Список белков, взаимодействующих с ДНК-полимеразами, постоянно растет и включает не только известные факторы PCNA , RF-C и RP-A , но и ключевые факторы регуляции клеточного метаболизма, такие как белки группы МСМ (minichromosome maintenance factors), ORC факторы узнавания участков ori репликации ORC (origin recognition complex), белок ретино-бластомы Rb и т.д.
Принципиальное значение имеет также установление того факта, что функционирование репликативных ДНК-полимераз альфа , дельта и эпсилон в ходе клеточного цикла регулируется с помощью специфических посттрансляционных модификаций, в частности, фосфорилирования. Значительный прогресс достигнут и в понимании роли ДНК-полимераз в репарации различных повреждений в клеточном геноме.
В целом, ДНК-полимеразы эукариот служат объектом регулярных обзоров в научной периодике [ Bamhara R.A. et al., 1995 , Brush G.S., et al., 1995 , Fisher P.A., 1994 , Wang T.S. et al., 1995 , Sugino А., 1995 , Wang T.S.-F., 1991 , Linn S., 1991 , Hubscher U., Thommes P., 1992 , Краевский А.А., Куханова М.К., 1986 ].
По специальным вопросам, связанным с изучением ДНК-полимераз, можно обратиться к следующим обзорам: пространственное строение ДНК-полимераз и механизм катализа - [ Johnson K.A., 1993 , Joyce C.M., Steitz Т.А., 1994 , Joyce C.M., Steitz Т.А., 1995 , Sousa R., 1996 ]; сравнение репликативных ансамблей эукариот и прокариот - [ Stillman B., 1994 , Baker Т.А., Bell S.P., 1998 ]; регуляция репликации ДНК у эукариот - [ CoverleyD., Laskey R.A., 1994 , Stillman B., 1996 ]; инициация репликации - [ Dutta A., Bell S.P., 1997 ]; участие ДНК-полимераз в репарации - [ Wood R.D., 1996 , Budd M.E., Campbell J.L.6 1997 ]; процессинг фрагментов Оказаки - [ Bambara R.A. et al., 1997 ].
