Регуляция на уровне инициации транскрипции у прокариот
Активность многих генов прокариот регулируется с помощью белковых факторов, взаимодействующих с регуляторными участками промоторов генов. При этом происходят как активация транскрипции генов, так и подавление считывания генетической информации РНК- полимеразами. В первом случае регуляторные белковые факторы называют активаторами , осуществляющими позитивную регуляцию транскрипции , а во втором - репрессорами . Регуляцию, связанную с подавлением транскрипции, называют негативной .
Механизмы стимулирования инициации транскрипции могут рассматриваться с двух точек зрения - кинетической и структурной. Активация промоторов путем образования открытых комплексов является лимитирующей стадией на пути активации транскрипции в целом, поэтому действие активаторов может быть охарактеризовано по изменению значений кинетических параметров реакций, происходящих на разных этапах активации. Так, при действии активирующего комплекса Crp-cAMP на lac-промотор происходит десятикратное увеличение равновесной константы ассоциации KB РНК- полимеразы с промотором с образованием закрытого комплекса. Активация промотора PRM фага лямбда , опосредованная cI-белком , характеризуется пяти-десятикратным увеличением константы скорости kf перехода закрытых комплексов в открытые.
Активирующее действие белка лямбда-cII на промотор РRE сопровождается изменением обоих кинетических параметров. Активация транскрипции может быть опосредована увеличением скорости освобождения промотора РНК-полимеразой после инициации синтеза РНК.
Многие активаторы транскрипции, в том числе и Crp-cAMP, сгибают молекулу ДНК после взаимодействия с ней, причем центр изгиба находится в сайте связывания активатора. С использованием мутантных белков было установлено, что изгибание ДНК и связывание активаторов с ДНК еще не обеспечивают активацию транскрипции.
Необходимым условием активации является наличие контакта между специфическими областями поверхностей молекул активатора и РНК-полимеразы, часто с ее альфа-субъединицами . Следствием образования контактов между активаторами и холоферментом РНК-полимеразы является синергизм в связывании обоих белков с соответствующими промоторами. Мутации в сайтах связывания активаторов или в промоторе могут предотвращать активацию транскрипции путем изменения конформации молекулы связанного активатора или контактного участка на РНК-полимеразе.
Последовательности нуклеотидов промоторных участков генов, с которыми взаимодействуют молекулы репрессора, получили название операторов . Во многих случаях репрессор связывается с оператором только в присутствии низкомолекулярного лиганда, специфически взаимодействующего с репрессором. Такие низкомолекулярные эффекторы получили название корепрессоров . Они часто требуются для функционирования белков-активаторов транскрипции.
Простейший механизм репрессии заключается в стерическом блокировании связывания РНК-полимеразы с промотором. Это происходит в том случае, если последовательности нуклеотидов мест посадки РНК-полимеразы на промотор и репрессора на оператор перекрываются.
Некоторые бактериальные белки-репрессоры могут оказывать негативное действие на этапы инициации, происходящие после связывания РНК-полимеразы с промотором. Например, молекулы репрессора gal-оперона E. coli , связавшиеся c операторами OE и OI , центры последовательностей которых расположены соответственно на расстояниях -60,5 и +53,5 по отношению к точке инициации транскрипции, вызывают образование петли участка ДНК, заключенного между ними, но не препятствуют взаимодействию РНК- полимеразы с промотором. Они действуют на этапы инициации, предшествующие образованию первой фосфодиэфирной связи. Если только одна молекула репрессора связывается с внешним оператором OE, он частично ингибирует транскрипцию путем взаимодействия с альфа-субъединицей РНК-полимеразы. Это сопровождается понижением уровня, но не полным прекращением синтеза РНК gal-оперона, т.е. более тонким изменением уровня экспрессии соответствующих генов.
Распространенным механизмом активации транскрипции с помощью белков-активаторов является облегчение ее инициации РНК- полимеразой после образования контакта между ферментом и белком- активатором, связанными с регуляторной областью промотора, что сопровождается конформационными изменениями РНК-полимеразы. У бактерий имеются белки-регуляторы, обладающие активностью как репрессора, так и активатора транскрипции, например, репрессор cI фага лямбда. Белок-активатор катаболитных оперонов (Crp-белок) активирует транскрипцию бактериальных генов, продукты которых участвуют в расщеплении органических соединений, используемых в качестве источника углерода. Свойства активатора Crp-белок приобретает лишь в комплексе с циклическим AMP ( сAMP ). Внутриклеточная концентрация сAMP возрастает у бактерий, растущих на бедных питательных средах, и понижается в условиях избытка источников углерода, поэтому система Crp-сAMP обеспечивает включение экспрессии катаболитных оперонов лишь на бедных питательных средах. Crp-белок может выступать и в роли репрессора транскрипции генов галактозного оперона E. coli . Все гены катаболитных оперонов активируются Crp-белком в присутствии сAMP, а негативная регуляция их транскрипции происходит индивидуально. Примерами являются регуляции транскрипции lac-оперона E. coli под действием Lac-репрессора и галактозного и арабинозного оперонов специфическими белками-репрессорами этих оперонов.
Низкомолекулярные эффекторы могут изменять активность РНК- полимеразы не только через белки-регуляторы, но и непосредственно при взаимодействии с ферментом. С помощью гуанозинтетрафосфата (ppGpp) в клетках E. coli осуществляется координация экспрессии генов рибосомных РНК (рРНК) и белков. Этот нуклеотид (известный под названием "магического пятна") синтезируется в условиях внутриклеточного недостатка аминокислот, что приводит к значительному снижению интенсивности транскрипции генов рРНК и белков и одновременной стимуляции синтеза РНК оперонов, контролирующих биосинтез аминокислот. В присутствии ppGpp очищенная РНК-полимераза прекращает синтез рРНК с одного из двух промоторов этих оперонов, что приводит к ослаблению их транскрипции. Известны мутации в гене бета-субъединицы РНК- полимеразы E. coli, приводящие к прекращению влияния ppGpp на синтез РНК, что подтверждает наличие непосредственного контакта между нуклеотидом и ферментом в процессе транскрипции.
Некоторые регуляторные элементы бактерий, участвующие в активации транскрипции, так же как и энхансеры эукариот, могут располагаться на большом расстоянии (нескольких сотен нуклеотидов) от промоторов, на которые они действуют. В этом случае контакт активатора с РНК-полимеразой обеспечивается благодаря выпетливанию участка ДНК, расположенного между данными регуляторными элементами, что приводит к пространственному сближению двух белков. Прямое доказательство образования таких петель на ДНК E. coli было получено с помощью электронной микроскопии для белков NtrC и NifA , действующих соответственно на промоторы генов glnA и nifH . Другим путем достижения белком- активатором молекулы РНК-полимеразы на удаленном промоторе (например, промоторе поздних генов бактериофага Т4) является его перемещение вдоль отрезка ДНК, разделяющего эти два регуляторных элемента. Процесс такого перемещения может быть инициирован последовательностями нуклеотидов, расположенными выше или ниже промотора на расстоянии нескольких сотен пар оснований.
Были получены доказательства изменения структуры ДНК в окрестностях промоторов под действием белков-активаторов для активации транскрипции. Так, в mer-локусе E. coli , обеспечивающем устойчивость бактериальных клеток к ионам ртути, связывание Mer- белка с регуляторным участком промотора (merT) в присутствии ртути сопровождается раскручиванием спирали ДНК в районе промотора примерно на 50 градусов, что приводит к образованию правильного расстояния между сайтами связывания активатора и промотором, так как первый расположен необычно - между нуклеотидами в положениях -35 и -10 промотора. Без такого изменения структуры ДНК связавшийся с ним активатор не может образовать правильного контакта с РНК-полимеразой.
