Репликативный комплекс E. coli: механизм действия
Две молекулы бета-белка входят в состав репликативного комплекса вслед за белками гамма-комплекса , связываясь с ДНК позади белков гамма-комплекса и оставляя 3'-конец праймера доступным для ДНК-полимеразы. Димер бета-белка образует кольцо вокруг молекулы ДНК и стимулирует АТРазную активность белков гамма-комплекса. Функциональный аналог бета-белка ( белок гена 45 бактериофага Т4 ) образует такую же пространственную структуру, охватывающую молекулу ДНК тремя молекулами. Молекулярная масса белка 45 составляет 2/3 от таковой бета-мономера, и их аминокислотные последовательности негомологичны друг другу. Тем не менее, четвертичные структуры этих полипептидов и механизмы их функционирования обладают большим сходством.
Бета-белки и белки гамма-комплекса, будучи связанными с дуплексом праймер-матрица, обеспечивают присоединение к этому комплексу минимального фермента ДНК-полимеразы . Затем ДНК- полимераза при наличии доступных четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, используя праймер для инициации синтеза ДНК, с высокой эффективностью синтезирует цепь ДНК, комплементарную ДНК-матрице. Те же самые белки участвуют и в синтезе отстающей цепи ДНК . В этом случае прерывистый синтез ДНК многократно инициируется на большом количестве праймеров, и ДНК синтезируется в виде фрагментов Оказаки длиной около 1000 нт. Синтез затравок, представляющих собой короткие последовательности РНК, обеспечивает продукт гена dnaG ( белок 61 фага Т4 ). ДНК- полимераза начинает элонгацию цепей ДНК, присоединяя первый дезоксирибонуклеозидмонофосфат к 3'-концевому нуклеотиду РНК- затравки. В процессе элонгации участвуют бета-белок и белки гамма-комплекса, которые перемещаются вдоль молекулы ДНК вместе с каталитической субъединицей ДНК-полимеразы.
Ведущая и отстающая цепи ДНК реплицируются координированно, что обеспечивается димеризацией ДНК-полимеразных комплексов. В таком димере, который образуется при участии тау-белка, один ДНК- полимеразный комплекс осуществляет непрерывный синтез ведущей цепи ДНК, а другой - фрагментов Оказаки отстающей цепи. Для димеризации ДНК-полимеразы III E. coli необходим тау-белок, в то время как продукт гена 43 бактериофага Т4 , по-видимому, изначально находится в виде димера. Другое различие репликативных комплексов E. coli и фага Т4 заключается в том, что холофермент ДНК-полимеразы E. coli сохраняется в виде стабильного комплекса и в отсутствие ДНК, тогда как холофермент Т4-ДНК-полимеразы существует только в присутствии матрицы.
Во время синтеза ДНК в репликативной вилке один и тот же белковый комплекс осуществляет как высоко процессивный непрерывный синтез ведущей цепи ДНК, так и прерывистый синтез фрагментов Оказаки отстающей цепи, претерпевая во втором случае периодическую диссоциацию от матрицы для инициации синтеза ДНК с каждого нового праймера. Для объяснения этого предположили, что холофермент ДНК-полимеразы способен узнавать 5'-конец каждого РНК-праймера, встречающегося после завершения синтеза очередного фрагмента Оказаки во время образования отстающей цепи ДНК в процессе репликации. Для проверки этого предположения в участок полипептидной цепи бета-белка, контактирующий с минимальным ферментом ДНК-полимеразы III, методами генной инженерии ввели аминокислотную последовательность, узнаваемую и фосфорилируемую протеинкиназой. Измеряя скорость фосфорилирования этих сайтов в условиях избытка протеинкиназы во время синтеза ДНК in vitro, определили кинетику ассоциации и диссоциации комплексов бета- белок-ДНК-полимераза по изменению уровня защищенности сайтов фосфорилирования от действия протеинкиназы. Оказалось, что во время связанного с синтезом фрагментов Оказаки перемещения минимального фермента ДНК-полимеразы и гамма-комплекса вдоль одноцепочечной ДНК-матрицы, покрытой SSB-белком , оба белка прочно связаны с бета-белком и матрицей. При встрече репликативного белкового комплекса с дуплексом, образованным матричной ДНК и РНК-затравкой, бета-белок остается связанным с вновь синтезированной ДНК, а у отделившихся ДНК-полимеразы и белков гамма-комплекса появляется возможность вступить в новый цикл синтеза фрагмента Оказаки путем взаимодействия с очередным дуплексом РНК-затравка-матрица. При этом вхождение ДНК-полимеразы в новый репликативный комплекс облегчается наличием в нем бета- белка и белков гамма-комплекса, ассоциированных с очередным РНК- праймером.
Таким образом, холофермент ДНК-полимеразы III обладает способностью распознавать молекулярное окружение, создаваемое матричной ДНК, осуществлять терминацию синтеза ДНК при наличии сигнала в виде дуплекса ДНК-затравка и реинициировать синтез ДНК на следующем праймере. Одна и та же молекула ДНК-полимеразы III в составе реплицирующего комплекса способна проводить синтез всех фрагментов Оказаки отстающей цепи реплицируемой ДНК, последовательно осуществляя инициацию, терминацию и реинициацию синтеза каждого из них.
После очередной терминации синтеза ДНК отстающей цепи 3'- конец вновь синтезированной ДНК оказывается вплотную приближенным к 5'-концу праймера следующего фрагмента Оказаки. Для соединения двух фрагментов с помощью ДНК-лигазы необходимы предварительное удаление РНК-праймера и достройка цепи ДНК в образующейся бреши. РНК-затравка удаляется с помощью РНКазы H, нуклеазы, специфически расщепляющей РНК в ДНК-РНК-гибридах, и(или) с участием 5'->3'- экзонуклеазы ДНК-полимеразы I. Во втором случае одновременно с удалением праймера происходит застройка образующейся бреши той же ДНК-полимеразой. В итоге два соседних фрагмента Оказаки вплотную приближаются друг к другу и оказываются отделенными лишь одноцепочечным разрывом, который может репарироваться ДНК- лигазой. Механизмы координации удаления РНК-праймеров из фрагментов Оказаки с самим процессом репликации ДНК пока не известны.
Кроме дуплексов праймеры-ДНК, холоферменты бактериальных и фаговых ДНК-полимераз, по-видимому, способны адекватно реагировать на другие стерические препятствия, возникающие на пути следования вдоль реплицируемой молекулы ДНК. В частности, ДНК-полимераза фага Т4 в процессе репликации может расходиться с транскрибирующими ту же ДНК молекулами РНК-полимеразы, не диссоциируя из репликативного комплекса и не вытесняя РНК- полимеразу с матрицы. Кроме того, репликативный комплекс может распознавать повреждения ДНК, возможно, маркированные специфическими белками, и прекращать репликацию соответствующего участка, останавливаясь или диссоциируя от матрицы. Репликация таких участков ДНК возобновляется после ликвидации повреждений ферментами репаративной системы. Для диссоциировавшей ДНК- полимеразы это становится возможным благодаря тому, что 3'-конец вновь синтезированной цепи ДНК в месте остановки репликации остается связанным с бета-белком, который облегчает повторное вхождение диссоциировавшей ДНК-полимеразы в репликативный комплекс.
