Рибозимы: использование против вирусов растений
Рибозимы, образующие структуру типа "головки молотка" , распознают в сайте расщепления РНК-мишени последовательности из трех нуклеотидов, рядом с которой происходит гидролиз цепи РНК. Подобными тринуклеотидами могут быть последовательности AUC, CUA, CUC, GUA, GUC, GUU и UUC. РНК-связывающий домен рибозима конструируют таким образом, что распознаваемый тринуклеотид входит в состав последовательности нуклеотидов, которая в двухцепочечной ДНК образует сайт рестрикции. Подобный подход дает возможность встраивать последовательность каталитического домена рибозима по этому сайту рестрикции в кДНК, полученную путем обратной транскрипции РНК-мишени. Каталитический домен рибозима оказывается фланкированным последовательностями антисмысловой РНК, комплементарной РНК-мишени, которые автоматически выполняют роль РНК-связывающего домена. При таком подходе отпадает необходимость в синтезе большого числа олигонуклеотидов, и в любом необходимом случае рибозим собирается из готовых блоков.
В качестве примера рассмотрим создание рекомбинантного рибозима, специфически расщепляющего РНК, содержащую последовательность сайта рестрикции SalI ( рис. II.26 ). После расщепления кДНК рестриктазой SalI (этап 1) образовавшиеся "липкие" концы гидролизуют нуклеазой S1 (этап 2) и по образовавшимся "тупым" концам встраивают каталитический домен рибозима, заключенный в двухцепочечном фрагменте ДНК (этап 3). В результате транскрибирования такой конструкции синтезируется антисмысловая РНК, в состав которой включен каталитический домен рибозима. После гибридизации с РНК-мишенью образуется двухцепочечная молекула РНК, на одной из цепей которой формируется структура рибозима типа "головки молотка" ( рис. II.27 ), расщепляющего РНК-мишень в строго определенном месте.
Описанный подход был реализован при конструировании рибозима, направленного против геномной РНК одного из вирусов сливы. При этом были получены последовательности нуклеотидов рибозима, пригодные для использования с другими 25 сайтами рестрикции.
