Трансляция: влияние на экспрессию рекомбинантных генов
На эффективность трансляции чужеродных мРНК в бактериальных клетках оказывает влияние первичная структура небольшого участка 5'-концевой части мРНК перед инициирующим AUG-кодоном, частично комплементарная 3'-концевой части 16S рРНК. Этот участок мРНК называют последовательностью Шайна-Дальгарно, или SD- последовательностью.
SD-последовательность мРНК служит сигналом для взаимодействия рибосом с мРНК и обеспечивает инициацию трансляции с правильного AUG-кодона. Она представляет собой короткую последовательность нуклеотидов, обогащенную пуриновыми основаниями, и расположена за 4-9 нуклеотидов перед AUG-кодоном: 16S рРНК HOAUUCCUCCACUAGG.....5' lacZ-мРНК ....UUCACACAGGAAACAGCUAUGACCAUGAUU...3'
Различия в эффективности распознавания такого сайта на мРНК рибосомами приводят к различиям в эффективности экспрессии соответствующих генов. Достаточно наличия в SD-сайте трех нуклеотидов, комплементарных соответствующему участку 16S РНК, чтобы рибосомы приобретали способность связывать эту мРНК. Помимо SD-последовательности в мРНК, по-видимому, имеются и другие участки, необходимые для эффективной инициации трансляции рибосомами, так как на основании только первичной структуры мРНК невозможно предсказать эффективность сайта связывания рибосом. Сайты инициации трансляции на мРНК, обладающие протяженной гомологией с 16S рРНК, являются малоэффективными, возможно, из-за слишком прочного связывания рибосом с мРНК.
Некодирующая 5'-концевая часть мРНК играет важную роль в эффективности ее трансляции рибосомами и особенности их трансляции необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии рекомбинантных генов в клетках E. coli.
Экспрессирующие векторы построены таким образом, что промотор, с которого начинается транскрипция клонированного гена и следующая за ним последовательность нуклеотидов, включающая инициирующий ATG-кодон, являются частью генов, эффективно экспрессирующихся в клетках E. coli. Сразу вслед за ATG-кодоном вектора располагают уникальные сайты рестрикции, по которым проводят встраивание кодирующей части клонируемого гена, экспрессию которого хотят получить. Если сайт рестрикции, по которому производится клонирование, расположен в начале кодирующей части природного гена, при транскрипции образуется химерная мРНК. 5'-Концевая часть этой мРНК от промотора до сайта рестрикции для клонирования соответствует последовательности нуклеотидов вектора и кодирует несколько аминокислот природного гена, регуляторные последовательности которого использовали для конструирования экспрессирующего вектора. Протяженная же 3'- концевая часть такой мРНК будет соответствовать клонированной последовательности нуклеотидов. Если соединение этих двух частей мРНК произошло в одной рамке считывания, то в результате ее трансляции будет образовываться химерный полипептид, N-концевая часть которого кодируется вектором, а С-концевая - клонированным фрагментом ДНК.
Примерами таких экспрессирующих векторов могут быть плазмиды pUC18 и pUC19 ( рис. II.5,б ), продукты экспрессии которых представляют собой химерные белки, а N-концевая часть содержит N- концевые аминокислотные остатки бета-галактозидазы E. coli.
Превосходным вектором, прекрасно зарекомендовавшим себя в работе, является экспрессирующий вектор pPR-TGATG-1 , сконструированный в лаборатории С.В. Машко (г. Москва).
Среди других факторов, оказывающих влияние на эффективность трансляции, следует упомянуть частоту встречаемости кодонов при кодировании белков в структурных частях разных генов. Установлено, что использование синонимических кодонов вырожденного генетического кода не случайно и отражает количественную представленность отдельных изоакцепторных тРНК в клетках организма. С другой стороны, частота использования кодонов в разных генах одного и того же организма является эффективным фактором, регулирующим уровень экспрессии этих генов в процессе трансляции. Чем реже тот или иной кодон используется для кодирования аминокислоты в данном организме, тем с меньшей скоростью он будет транслироваться рибосомами вследствие низкой внутриклеточной концентрации тРНК, узнающей такой кодон. Так, в группе белков дрожжей с высоким уровнем экспрессии 96% аминокислот кодируются только 25 из 61 возможного кодона. Замена этих 25 предпочтительных кодонов в 5'-концевых частях генов белков с высоким уровнем экспрессии на редко встречающиеся кодоны снижает уровень синтеза как белков, так и их мРНК.
На эффективность трансляции кодона оказывает влияние и контекст кодона, т.е. соседние, окружающие кодон последовательности нуклеотидов. Этот феномен предпочтительного использования одних кодонов перед другими необходимо учитывать в опытах по оптимизации экспрессии чужеродного генетического материала в гетерологичном генетическом окружении, поскольку несоответствие в частотах использования кодонов у организмов разных видов может служить серьезным препятствием для получения эффективной экспрессии клонируемых генов. Снижение уровня экспрессии под влиянием подобных факторов, в частности, наблюдали при попытках экспрессии генов растений в клетках дрожжей, а также в других гетерологичных системах.
Таким образом, эффекты, возникающие в связи с различной частотой использования кодонов, необходимо учитывать при подборе генетических систем для эффективной экспрессии клонированных чужеродных генов. Этот фактор может оказаться одним из решающих при получении полностью синтетических генов, например, генов пептидных гормонов, для использования их в биотехнологии, а также при планировании мутационных замен нуклеотидов в белковой инженерии.
