Электрофорез продуктов ПЦР в денатурирующем градиентном геле
Электрофорез продуктов ПЦР в денатурирующем градиентном геле ( DGGE - denaturing gradient gel electrophoresis ).
Последовательность нуклеотидов в двухцепочечных фрагментах ДНК определяет особенности плавления этих фрагментов в денатурирующих условиях. Мутации (в том числе и одиночные замены нуклеотидов) изменяют температуру плавления (денатурации) доменов ДНК, содержащих эти мутации.
Совокупность доменов плавления определенного участка ДНК образует профиль плавления. Домены ДНК в зависимости от последовательности их нуклеотидов в условиях постоянной температуры будут плавиться при определенных концентрациях денатурирующего агента. В результате положение фрагментов в геле по завершении электрофореза будет зависеть от профилей их плавления и, в конечном счете, от нуклеотидной последовательности доменов плавления. Фрагмент ДНК, содержащий мутацию, плавится при другой концентрации денатурирующего агента в геле и двигается с другой скоростью при электрофорезе по сравнению с аналогичным фрагментом ДНК дикого типа.
Присутствие ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatches) , как правило, увеличивает разницу в температурах плавления мутантных фрагментов ДНК и фрагментов ДНК дикого типа, поэтому можно увеличить чувствительность метода путем сравнения электрофоретических подвижностей фрагментов ДНК дикого типа и гетеродуплексов, образованных фрагментом исследуемой ДНК и соответствующим фрагментом ДНК дикого типа.
С появлением метода ПЦР получение фрагментов ДНК определенной длины, полностью идентичных анализируемому участку ДНК, стало простой задачей. Для повышения разрешающей способности электрофореза в денатурирующем градиентном геле один из праймеров при проведении ПЦР выбирают таким образом, чтобы его GC-состав был максимально возможным. Это предотвращает преждевременную полную денатурацию и расхождение цепей продуктов ПЦР во время электрофореза, так как противоположные цепи денатурирующих фрагментов ДНК будут более продолжительное время связаны друг с другом GC-богатыми последовательностями праймеров.
Метод электрофоретического разделения фрагментов ДНК в гелях с градиентом денатурирующих агентов позволяет обнаруживать до 95% мутаций, но не дает возможности точно локализовать мутации в анализируемых участках ДНК.
