DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) Метод
DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) - метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза - основан на зависимости свойств плавления (или денатурации) небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-пар в исследуемых фрагментах [ Майерс Р. и др., 1990 ; Fodde R., Losekoot M., 1994 ]. Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т. Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях ( рис. 4.5 ). Градиент денатурации достигается разницей температур, различной концентрацией мочевины или формальдегида в гелях. При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК, отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют по-разному. Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности [ Lerman L.S., Silverstein К., 1987 ].
При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре плавления - tm, т. е. такой температуре, при которой каждая пара оснований с 50 % вероятностью может соединиться или разойтись. После начала плавления продвижение двухнитевого фрагмента ДНК в геле резко замедляется вследствие сложной пространственной конфигурации молекул, причем эта задержка будет длиться до тех пор, пока не наступит полная денатурация ДНК. В результате происходит разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Таким способом удается идентифицировать лишь около 50% однонуклеотидных замен в фрагментах ДНК длиной от 50 до нескольких сотен нуклеотидов. Связано это с тем, что при прохождении ДНК через гель может начаться частичная денатурация концов молекул еще до достижения оптимальной области плавления. Поэтому мутации, локализованные вблизи концов амплифицированных участков ДНК, оказывают меньшее влияние на процесс плавления и могут не выявляться.
Эффективность обнаружения мутаций с помощью градиентного денатурирующего электрофореза может быть существенно повышена за счет присоединения к концам амплифицированной геномной ДНК синтетических фрагментов GC-нуклеотидов длиной в несколько десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие концы выполняют роль своеобразных зажимов и резко увеличивают шансы обнаружения всех точечных мутаций, независимо от их локализации внутри исследуемого фрагмента ДНК. Эта модификация делает метод очень чувствительным ( табл. 4.2 ). В отличие от SSCP , он пригоден для более крупных амплифицированных фрагментов ДНК. При исследовании фрагментов до 600 п.о. эффективность выявления мутаций этим методом достигает 95%. Чаще всего DGGE-метод применяется для скрининга мутаций в амплифицированных экзонах, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК.
Этот метод может быть с успехом применен также для анализа индуцированных мутаций , так как позволяет улавливать точечные мутации, возникшие даже в одной из 100 обработанных мутагеном клеток. К недостаткам метода следует отнести техническую сложность получения равномерного градиента денатурирующего агента в полиакриламидном геле, а также высокую стоимость искусственно синтезированных GС-концов.
