Система сопряженного праймирования для мутагенеза
Для проведения замены нуклеотидов синтезируют 15-20-членный олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный одной из цепей ДНК исследуемого гена ( рис. II.17,а ). Мутагенизируемый ген клонируют в фазмидном векторе, который переводят в одноцепочечную форму. После выделения такой одноцепочечной ДНК с клонированным геном дикого типа с ней гибридизуют синтетический олигонуклеотид и, используя его в качестве затравки, синтезируют с помощью фрагмента Кленова in vitro комплементарную цепь ДНК. Образующаяся двухцепочечная кольцевая молекула ДНК представляет собой гетеродуплекс, дочерняя цепь которого комплементарна исходной родительской цепи на всем протяжении, кроме участка, занимаемого олигонуклеотидом, где мутантный нуклеотид некомплементарен соответствующему нуклеотиду матрицы.
Остающийся после завершения синтеза дочерней цепи ДНК одноцепочечный разрыв ликвидируют с помощью ДНК-лигазы, а образовавшуюся двухцепочечную ковалентно замкнутую ДНК вводят в бактериальные клетки, где она проходит несколько раундов репликации. После первого раунда репликации происходит сегрегация в разные молекулы ДНК мутантного аллеля и аллеля дикого типа исследуемого гена, и далее эти молекулы продолжают реплицироваться независимо друг от друга, что приводит к образованию двух популяций рекомбинантных ДНК, содержащих изучаемый ген в мутантной и исходной формах. Таким образом, теоретически каждая вторая молекула, выделенная из подобных бактериальных клеток, должна содержать в клонированном гене требуемую мутацию, локализованную в строго определенном сайте.
Для того, чтобы отличить мутантные ДНК от нормальных, проводят либо прямое секвенирование мутагенизируемого участка гена, либо гибридизацию рекомбинантных молекул с олигонуклеотидом, ранее использованным в качестве затравки, предварительно меченным радиоактивными изотопами. Связь этого олигонуклеотида, содержащего замены нуклеотидов, в гибриде будет более прочной с мутантной ДНК, чем с ДНК дикого типа, так как в первом случае олигонуклеотид и ДНК будут полностью комплементарны друг другу. Плавление гибрида и отделение олигонуклеотида от ДНК произойдут при более низких температурах, если гибрид был образован с ДНК дикого типа, а не с мутантной ДНК. Освободившиеся в результате плавления гибридов олигонуклеотиды отделяют от ДНК промыванием комплекса на фильтрах, что проявляется в отсутствие сигнала при авторадиографии, тогда как в случае гибридов олигонуклеотида и мутантной ДНК будет появляться четкий сигнал.
На практике частота возникновения мутантных ДНК в популяции рекомбинантных мутагенизируемых молекул значительно > 50%. Основными причинами этого являются 3'->5'-экзонуклеазная активность фрагмента Кленова и его способность вытеснять цепь ДНК в направлении 5'->3'. Для преодоления этих затруднений мутантные нуклеотиды в олигонуклеотидном праймере располагают не ближе, чем за четыре нуклеотида от его 3'-конца и для синтеза комплементарной цепи в мутагенизируемой одноцепочечной молекуле ДНК используют систему из двух праймеров ( рис. II.17,б ).
В этой системе второй праймер выбирается таким образом, чтобы его 3'-конец после гибридизации с мутагенизируемой одноцепочечной молекулой ДНК располагался на расстоянии 1-3 т.п.о. от фосфорилированного 5'-конца мутагенизирующего нуклеотида. В этом случае после заполнения бреши между двумя олигонуклеотидами вновь синтезированной ДНК, синтез которой начался с дополнительного праймера, произойдет лигирование одноцепочечного разрыва ДНК-лигазой, которая присутствует в реакционной смеси вместе с фрагментом Кленова, поскольку 5'-конец мутагенизирующего нуклеотида фосфорилирован. Однако здесь не образуется кольцевой ковалентно замкнутой молекулы ДНК, так как на 5'-конце дополнительного праймера отсутствует фосфатная группа. После завершения реакции образовавшимися молекулами ДНК трансформируют клетки E. coli и производят отбор мутантных молекул ДНК в клонах бактерий по гибридизации с мутагенизирующим олигонуклеотидом, меченным радиоактивным изотопом.
