Векторы космидные и фазмидные
Фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15-25 т.п.о. этого недостаточно для клонирования генов животных и растений, длина которых превышает 35-40 т.п.о. Требуемой емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами ( рис. II.8 ).
Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos-сайты ДНК фага лямбда . Отсюда происходит название всего типа данных векторов (cosmid). В ДНК нормальных фаговых частиц cos-сайты расположены на концах молекул, они разделяют мономеры фаговой ДНК в конкатемерах , объединяющих несколько соединенных "голова к хвосту" мономеров, которые являются предшественниками зрелых фаговых ДНК перед упаковкой в фаговые частицы. В таких конкатемерах соседние cos-сайты располагаются на расстоянии 35-45 т.п.о. друг от друга и заключают между собой весь фаговый геном. В процессе упаковки cos-сайты узнаются компонентами ферментативной системы и по ним происходит последовательное отрезание упакованной в фаговую частицу лямбда-ДНК от остальной неупакованной ДНК конкатемера.
Наличие cos-сайтов в ДНК является единственным необходимым условием упаковываемости ДНК в фаговые частицы. Это означает, что последовательность нуклеотидов лямбда-ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, которая заключает в себе весь фаговый геном (35-45 т.п.о.), может быть замещена in vitro на аналогичный по длине фрагмент чужеродной ДНК и упакована в фаговые частицы. Такая искусственная фаговая частица оказывается нежизнеспособной. Однако после адсорбции химерной фаговой частицы на поверхности бактериальной клетки заключенная в ней ДНК проникает (вводится фаговой частицей) внутрь бактерии и начинает автономно реплицироваться как плазмида, размер которой составляет 30-40 т.п.о. Поскольку такая плазмида (космида) содержит в своем составе селектируемые маркеры в виде генов устойчивости к антибиотикам, ее поддерживают в бактериальных клетках путем выращивания бактерий на среде с соответствующими антибиотиками. Несмотря на то, что емкость космидных векторов значительно выше фаговых, эффективность клонирования в космидах ниже, хотя и достигает в ряде случаев 105-106 колоний на 1 мкг клонируемой ДНК. При такой эффективности упаковки требуется всего лишь 2-4 мкг клонируемой ДНК для получения полной клонотеки большинства эукариотических геномов.
Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции. В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако сходство является более глубоким в случае векторов, называемых фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для лямбда-векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий.
Прогулки и прыжки по хромосомам
