Клонотеки генов: получение
На рис. II.8 представлена схема конструирования клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора . Общие принципы получения клонотек генов приложимы и к другим векторам, плазмидным или фаговым.
На первом этапе осуществляют подготовку вектора и клонируемой ДНК. Космидный вектор расщепляют рестриктазами BamHI и SmaI, причем рестриктаза SmaI расщепляет ДНК с образованием "тупых" концов. В результате образуются два "плеча" космидного вектора, содержащих область начала репликации ori , используемую системой репликации бактериальных клеток, и два селектируемых маркера, которые представляют собой гены устойчивости к антибиотикам - ампициллину (Ampr) и канамицину (Kanr) , а также два cos-сайта хромосомы бактериофага лямбда. Параллельно получают препараты высокомолекулярной ДНК, которую необходимо клонировать.
Геномную ДНК подвергают частичному гидролизу мелкощепящей рестриктазой MboI (узнает последовательность из четырех нуклеотидов GATC, которые комплементарны "липким" концам, образуемым рестриктазой BamHI). Время рестрикции и концентрацию фермента подбирают таким образом, чтобы средняя длина образующихся фрагментов ДНК составляла 35-45 т.п.о. Обогащенную фракцию фрагментов ДНК далее получают центрифугированием смеси рестрикционных фрагментов в градиенте концентрации сахарозы и лигируют с приготовленными "плечами" вектора в условиях, при которых образование сшивок по "тупым" концам минимально. При этом, помимо требуемых молекул рекомбинантных ДНК, могут образовываться и артефактные молекулы, которые не будут упаковываться в фаговые частицы либо из-за их неоптимального размера, либо вследствие неправильной ориентации cos-сайтов.
Полученную после лигирования смесь молекул рекомбинантных ДНК упаковывают в фаговые частицы стандартным способом, и образовавшимися фаговыми частицами заражают подходящие бактериальные клетки. В итоге колонии бактериальных клеток, которые выросли в присутствии антибиотиков, должны заключать в себе различные последовательности нуклеотидов клонируемой ДНК приблизительно одинаковой длины.
Для получения репрезентативных клонотек генов следует помнить о необходимости случайной фрагментации клонируемой высокомолекулярной ДНК, с тем чтобы все участки генома в образующейся смеси фрагментов были представлены равновероятно. Кроме того, размеры образуемых фрагментов ДНК должны соответствовать емкости вектора, используемого для их клонирования. Так, для клонирования в космидах необходимо получать фрагменты ДНК длиной 35-45 т.п.о., тогда как для клонирования в фаговых векторах типа Charon и плазмидах эти размеры должны составлять соответственно 20-24 и 1,5-3,0 т.п.о. Чем короче фрагменты, используемые для получения библиотек генов, и чем сложнее исследуемый геном, тем большее число клонов необходимо получить, чтобы клонотека была полной. Например, для того, чтобы создать геномную клонотеку бактерий из фрагментов ДНК длиной в 20 т.п.о., в которой любая последовательность была бы представлена с вероятностью 99%, в ней необходимо иметь 460 клонов, для млекопитающих это число возрастает до 600000, а для покрытосеменных растений примерно в 10 раз больше. Отсюда следует, что для получения репрезентативных клонотек генов бактерий достаточно плазмидных векторов, несмотря на их небольшую емкость, а для создания полных клонотек генов млекопитающих или растений использование плазмидных векторов бесперспективно, так как потребовало бы поддержания в клонотеке огромного количества клонов, многие из которых с большой вероятностью могут быть утрачены.
