Микроцин B17 (микроцин B, McB): основные характеристики
Проблема возрастающей устойчивости бактерий к антибиотикам беспокоит врачей во всем мире. По данным Европейского медицинского агенства, в 2009г. более 2000 смертей было вызвано неизлечимыми бактеральными инфекциями. Особенно осторо стоит роблема множественной лекарственной устойчивости у граммотрицательных бактерий [ 1 ]. В то же время, практически все классы антибиотиков, используемых в настоящее время, являются потомками нескольких веществ, открытых не позднее 60-х годов XX века [ 2 ]. К сожалению, антибиотики, которые применяются относительно редко и в течение короткого времени, являлись невыгодным вложением денег для фармацевтических компаний и длительный период времени не изучались. К тому же, многие традиционные источники антимикробных веществ (например, почвенные микроорганизмы) исчерпали себя.
В последние годы бурное развитие геномики привело к предсказанию огромного числа новых потенциальных вторичных метаболитов в окружающем нас бактериальном сообществе, при этом уже описанные вещества представляют собой только вершину айсберга. Изучая вторичный метаболизм, можно надеяться найти антибактериальные вещества с принципиально новой структурой и механизмом действия.
В природе существует несколько стратегий синтеза биологически активных вторичных метаболитов. Одна из них - это использование рибосомы для синтеза неактивных пептидов-предшественников. После посттрансляционной модификации, эти неактивные предшественники приобретают жесткую структуру, необходимую для выполнения той или иной функции. Преимуществ у такой стратегии несколько:
во-первых, наладить производство вторичных метаболитов из рибосомально синтезируемых пептидов относительно проще для организма, чем создавать систему нерибосомального пептидного синтеза;
во-вторых, мутации, позволяющие повысить химическое разнообразие, производятся на генетическом уровне и не требуют принципиальных изменений ферментативной машинерии; и
в-третьих, превращение неактивных предшественников в активные метаболиты может быть проконтролировано на посттрансляционном уровне, позволяя организму быстро отвечать на изменения окружающей среды.
По такой стратегии производятся два основных класса пептидных вторичных метаболитов: лантипептиды и ТОММ (тиазол-оксазол модифицированные микроцины) . Лантипептиды содержат (метил)лантиониновые внутримолекулярные сшивки, вводимые путем присоединия тиолов цистеина к дегидратированным остаткам серина или треонина . В классе ТОММ, остатки цистеина , серина и треонина подвергаются гетероциклизации, что ограничивает конформационную подвижность пептида, придавая ему необходимую жесткость.
Тиазольные и оксазольные гетероциклы широко распространены в биоактивных соединениях и могут участвовать в выполнении самых разных функций как в ТОММ, так и в других натуральных и синтетических веществах [ 3 ]. Такими веществами являются например: ингибитор рибосомы тиострептон , антираковое вещество транкамид , ингибитор ДНК-гиразы микроцин Б , индуктор вторичного метаболизма гоадспорин , сидерафор ерсиниабактин и ингибитор протеазы ВИЧ ритонавир . Целый ряд биоинформатических и биохимических исследований говорит о распространенности пептидов, содержащих пост-трансляционно образованные тиазольные и оксазольные гетероциклы в природе. К таким пептидам относится цианобактины , стрептолизин , тиациллины и др [ 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ]. Биохимические детали формирования ароматических гетероциклов из полипептидных цепей представляют значительный интерес, так как многие модифицированные пептиды обладают потенциально интересными фармакологическими свойствами. Предполагается, что ферментативные комплексы, осуществляющие модификацию пептидов, могут быть использованы для получения новых синтетических биологически активных веществ [ 13 ].
Описаны два типа ферментных комплексов, выполняющих реакции гетероциклизации. Наиболее изучен комплекс, осуществляющий модификацию микроцина Б - McbBCD синтетаза . Структурный белок McbD узнает лидерный пептид предшественника микроцина и движется вдоль него в N->C направлении. Встречая дипептиды Gly-Ser или Gly-Cys, циклодегидратаза McbC превращает остаток серина или цистеина в оксазолиновый или тиазолиновый цикл, соответственно, после чего дегидрогеназа McbB окисляет цикл до ароматического оксазола или тиазола . Вариантов микроцина с оксазолиновыми или тиазолиновыми кольцами не было обнаружено, поэтому считается, что ароматизация следует непосредственно за циклизацией без диссоциации ферментного комплекса [ 14 , 15 , 16 ]. У ферментов второго типа, к которым относятся белки TruD и PatD , осуществляющие модификации предшественников цианобактинов, субстрат-узнающая и гетероциклизующая активности находятся на одном полипептиде, а дегидрогеназная активность отсутствует. Таким образом, продуктом первичной модификации являются пептиды с оксазолиновыми и тиазолиновыми комплексами, которые затем частично окисляются неизвестными клеточными белками [ 9 ].
Одним из первых открытых представителей класса ТОММ является ингибитор ДНК-гиразы микроцин Б17 (микроцин Б, McB) [ 17 , 18 ]. Микроцин Б это пептид массой 3094 Да, содержащий тиазолы и оксазолы , который ингибирует бактериальную топоизомеразу типа II - ДНК-гиразу . Производство и иммунность к микроцину Б требует присутствия семи генов: mcbA , mcbB , mcbC , mcbD , mcbE и mcbG . Эти гены образуют оперон , который встречается на природных плазмидах . Микроцин Б синтезируется из продукта гена mcbA - глицин-богатого полипептида длиной 69 а.к. Активность ферментативного комплекса McbBCD превращает некоторые из серинов и все цистеины в этом предшественнике в оксазольные и тиазольные гетероциклы. После образования модифицированного микроцина Б (промикроцина), протеазы TldD и TldE отщепляют лидерный пептид [ 19 ] и зрелый микроцин транспортируется из клетки с помощью ABC-зависимых транспортеров McbD и McbE . Продукт гена mcbG , принадлежащего к семейству белков с пентапептидными повторами, взаимодействует с ДНК-гиразой, предоставляя дополнительную защиту от производимого микроцина клетке.
Проведенные биохимические исследования [ 20 , 21 , 22 ] позволили установить, что микроцин Б способствует стабилизации переходных комплексов гиразы с расщепленной ДНК, что в дальнейшем приводит к накоплению двухцепочечных разрывов ДНК, ингибированию репликации и индукции SOS-ответа . Таким образом, действие микроцина напоминает действие клинически значимых фторхинолоновых антибиотиков . Тем не менее, механизм действия микроцина отличается от механизма действия хинолонов . В противоположность хинолонам микроцин Б ингибирует сверхспирализацию и релаксацию ДНК только частично, вернее он замедляет эти реакции. В то время как хинолоны увеличивают скорость образования обоих разрывов в G-сегменте ДНК, микроцин Б ускоряет образование только второго разрыва. В отсутствие AТP микроцин незначительно стабилизирует переходный комплекс в реакции с релаксированной ДНК в качестве субстрата; в то же время стабилизация переходного комплекса хинолонами не зависит от AТP. Наконец, для ингибирования реакции сверхспирализации микроцином В требуется фрагмент ДНК длиной минимум 150 пар оснований, что не характерно для ингибирования реакции хинолонами и свидетельствует в пользу того, что образование тупикового тройного комплекса (ДНК-микроцин-фермент) происходит на стадии переноса Т-сегмента через ДНК-ворота гиразы. При этом эффективность переноса Т-сегмента через разрыв в G-сегменте снижается примерно в 3 раза. Фактический сайт взаимодействия микроцина Б с гиразой не известен [ 23 ].
В данной работе проведен систематический структурно-функциональный анализ микроцина Б. Структура микроцина проанализирована при помощи масс-спектрометрических и химических методов, а также с помощью мутационного анализа. Установлены ранее неизвестные детали структуры антибиотика и получено большое количество данных по влиянию первичной структуры на синтез и антибактериальную активность микроцина Б in vivo и in vitro.
McB - микроцин Б
