Оперон mcc содержит внутренние промоторы
В первых двух разделах " РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СИНТЕЗА McC " и " Трансляционная аттенюация в других mcc оперонах " мы продемонстрировали механизм, при помощи которого в микроциновых оперонах E. coli и других бактерий со сходной организацией оперона обеспечивается высокое соотношение пептида MccA и аденилирующего его фермента MccB . Однако при экспрессии микроциновых генов имеется еще одна проблема: начало синтеза антибиотика раньше синтеза белков иммунности (ферментов-инактиваторов и/или экспортных помп) может приводить к отравлению клетки. В различных микроциновых кластерах эта проблема решается по-разному. В кластере синтеза микроцина J25 ( McJ ) mcjABCD ген структурного пептида антибиотика mcjA и гены синтеза и иммунности mcjBCD расположены в отдельных разнонаправленных оперонах [ Moreno, 2002 ]. Промотор перед опероном mcjBCD, содержащем mcjD , необходимый компонент экспортной помпы, активируется еще в экспоненциальной фазе роста, а промотор перед геном пептида- предшественника - только в стационарной фазе [ Delgado, 2001 ].
Таким образом, к моменту появления антибиотика в клетке уже присутствует экспортная помпа для удаления его из клетки. Иначе организован кластер mcbABCDEFG синтеза микроцина B17 (MCB). Здесь mcbBCD - гены синтеза антибиотика, продукты mcbEF образуют экспортную помпу, продукт mcbG - ген иммунности. Перед четырьмя генами оперона имеется основной промотор, который активируется при входе культуры клеток в стационарную фазу роста. Перед mcbD также имеется отдельный, довольно слабый конститутивный промотор, с которого транскрибируется mcbDEFG , что позволяет поддерживать минимальную концентрацию белка иммунности в клетке еще до начала синтеза антибиотика [ Genilloud, 1989 ] . Имеется также внутренний антисенс промотор, который, по всей видимости, может снижать экспрессию с основного промотора оперона [ Moreno, 2002 ]. Кластер генов синтеза McС ( Рис. 10 ) по организации напоминает кластер mcb , однако наличие каких- либо защитных регуляторных механизмов для кластера mcc ранее не исследовалось.
Как было показано в разделе " РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ И РОЛЬ ГЕНОВ ИММУННОСТИ В СИТЕЗЕ McC ", mccF экспрессируется конститутивно, в отличие от экспрессии генов основного оперона, которая зависит от фазы роста культуры. Конститутивная активность промотора mccF гарантирует появление белка иммунности MccF в клетке раньше появления зрелого антибиотика. Однако, как описано выше, даже при делеции mccF синтез McC не нарушается, и клетки, несущие такой кластер почти не теряют в скорости роста. Следовательно, должны существовать какие-то дополнительные механизмы, делающие клетку иммунной к McC на ранних стадиях роста при отсутствии mccF.
Ранние работы, описывающие кластер микроциновых генов, позволяли предположить, что помимо основного cAMP-CAP-зависимого промотора Pmcc существуют один или несколько внутренних промоторов, поскольку помещение беспромоторных фрагментов mcc кластера от С- концевого участка mccB до середины либо до конца mccE на плазмиды давало частичную устойчивость трансформантов к действию McC [ Novoa, 1986 ]. В нашей лаборатории была получена плазмида, несущая кластер микроциновых генов, в котором в -10 последовательность промотора Pmcc внесена инактивирующая мутация (TAAAAA->TGCCCC). Такая мутация была внесена в плазмиды pp70 , pp70-F и pp70-E-F , где "-E" означает инактивирующую мутацию в активном центре С-концевого ацетилазного домена MccE, "-F" - в активном центре карбоксилазного домена MccF . Вначале мы оценили чувствительность к McC клеток, несущих мутантные плазмиды ( Рис. 25 ).
Как видно, клетки, несущие кластер с неактивным промотором, полностью устойчивы к McС. В таких клетках не нарушена экспрессия mccF, дающего полную устойчивость к McC [ Gonzаlez-Pastor, 1995 ; Novoa, 1986 ; Tikhonov, 2010 ]. Клетки, несущие на плазмиде mcc кластер, кодирующий неактивный MccF ( pp70 - Pmcc-F ) не обладали полной устойчивостью, однако были менее чувствительны к McC, чем клетки без плазмиды. И наконец, плазмида pp70-Pmcc-E-F не придавала клеткам дополнительной устойчивости к микроцину . Зоны ингибирования роста, образованные при нанесении McC на газон таких клеток, были того же размера, что и в случае контрольных чувствительных клеток, однако имели более четкие границы и не имели широкого зарастающего края, что может свидетельствовать о незначительном понижении чувствительности. В клетках, несущих плазмиды pp70-Pmcc , отсутствовала продукция McC, а также не детектировались транскрипты mccA и mccB , что подтверждает отсутствие промоторной активности мутантного промотора Pmcc . Таким образом, устойчивость к McC клеток, несущих pp70- F, вероятно, должна обеспечиваться наличием дополнительного промотора или промоторов перед генами устойчивости mccC и/или mccE .
