Трансляционная аттенюация в других mcc оперонах
mcc-Подобные опероны встречаются среди многих микроорганизмов, в том числе филогенетически не близких E. coli [ Severinov, 2007 ]. Пока ни для одной из таких бактерий не показана продукция in vivo активного антибактериального вещества, подобного МсС . Тем не менее в нашей лаборатории были синтезированы in vitro несколько McC-подобных веществ путем аденилирования химически синтезированных предсказанных MccA пептидов соответствующими MccB -подобными ферментами. Также было показано, что полученные пептидил-аденилаты обладают антибактериальной активностью [ Bantysh, 2014 ]. Большинство идентифицированных к настоящему моменту mcc-подобных оперонов организованы сходным образом и, в частности, подобно оперону E. coli , содержат длинную область между генами mccA и mccB, в которой имеется инвертированный повтор - потенциальный фактор-независимый терминатор транскрипции [ Severinov, 2007 ; неопубликованные данные О. Бантыш и С. Дубилей]. При таком сходстве структур mcc оперонов различных организмов можно ожидать и сохранения основных регуляторных механизмов, контролирующих синтез соответствующих антибиотиков.
Штамм Helicobacter pylori G27 [ Baltrus, 2009 ] содержит mcc- подобный оперон в составе плазмиды pHPG27 (NC_011334) . Оперон mcc H. pylori кодирует лишь три гена, mccA , mccB и mccC ( Рис. 18 ,А). В лаборатории Cynthia M. Sharma был проведен dRNAseq анализ РНК, выделенной из клеток этого штамма [неопубликованные данные S. Pernitzsch и C. Sharma], который выявил транскрипты оперона mcc in vivo. Также было показано, что, как и в случае оперона mcc E. coli, c оперона mcc H. pylori наряду с полицистронным транскриптом производится моноцистронный транскрипт mccA. Межгенный участок mccA-mccB оперона H. pylori имеет длину 84 п.о. (соответствующий участок E. coli имеет длину 74 п.о.) и содержит инвертированный повтор, который мог бы образовывать шпильку в насцентном транскрипте и стимулировать фактор-независимую терминацию транскрипции.
Чтобы проверить, образуется ли короткий транскрипт in vitro и необходимо ли для этого сопряжение транскрипции и трансляции, мы использовали в совмещенной системе транскрипции-трансляции остановленные элонгационные комплексы, сформированные на матрице, содержащей фрагмент Т7 A1(-67+30), слитый с фрагментом (+1+137) mcc оперона H. pylori. Результаты in vitro транскрипции представлены на Рис. 18 ,Б. При возобновлении элонгации добавлением компонентов системы PURExpress дельтаRibosome синтезировался только полноразмерный транскрипт ( Рис. 18 ,Б, дорожка 1).
При добавлении в реакцию системы PURExpress, содержащей рибосомы, мы наблюдали появление дополнительного укороченного продукта транскрипции ( Рис. 18 ,Б, дорожки 2 и 3), размер которого соответствовал ожидаемому продукту терминации транскрипции на фактор-незaвисимом терминаторе, образованном шпилькой в межгенном участке. Появление продукта терминации наблюдалось как при наличии, так и при отсутствии аминокислот и тРНК в реакциях ( Рис. 18 ,Б, дорожки 3 и 2, соответственно). Следовательно, для стимуляции терминации транскрипции не требуется продвижение рибосомы по РНК-матрице.
В Табл. 1 представлен список mcc-подобных оперонов, в которых за геном mccA следует межгенный участок, содержащий инвертированный повтор, который может образовывать шпильку и при транскрипции потенциально формировать фактор-независимый терминатор транскрипции. Почти во всех случаях такой участок расположен между генами mccA и mccB. Исключение составляет mcc оперон гаммапротеобактерии Yersisnia pseudotuberculosis , где за mccA следует гомолог гена mccC. Также выбивается из общего ряда mcc оперон цианобактерии Synechococcus sp. , в котором протяженный межгенный участок с инвертированным повтором разделяет дуплицированные гены mccA, а второй ген mccA отделен от mccB лишь очень коротким промежутком, в котором не обнаруживаются инвертированные повторы или другие элементы, которые могли бы образовать вторичную структуру на РНК. Последовательности межгенных участков mcc оперонов этих организмов приведены в Табл. 2 .
Для первичного выявления дополнительных mcc-подобных оперонов с трансляционной аттенюацией были выбраны четыре оперона, содержащих достаточно длинные межгенные участки mccA-mccB с инвертированными повторами. Среди отобранных оперонов было три представителя гаммапротеобактерий ( Haemophilis somnus , Pectobacterium wasabiae , Photorhabdus luminescence ) и один - альфапротеобактерии ( Bartonella washoensis ).
Чтобы проверить способность рибосомы стимулировать терминацию транскрипции, мы использовали химерные матрицы, содержащие фрагмент модифицированной Т7 A1 матрицы (-67+30), слитый с начальным участком mcc оперона, включающим с последовательность Шайна-Дальгарно , рамку считывания mccA, межгенный участок и начало следующего гена. Все выбранные mcc опероны содержали последовательность Шайна-Дальгарно, которая узнается рибосомой E. coli. Результаты эксперимента представлены на Рис. 19 .
В случае mcc оперонов бактерий Pectobacterium wasabiae и Photorhabdus luminescence наблюдалась значительная стимуляция терминации транскрипции при добавлении к остановленным элонгационным комплексам рибонуклеотидов и компонентов полной системы PURExpress, тогда как при добавлении только смеси рибонуклеотидов синтезировался лишь полноразмерный продукт ( Рис. 19 , дорожки 1 и 2, 3 и 4). Межгенные участки обоих оперонов кодируют стабильную GC-богатую шпильку, за которой в случае P. luminescence также следует легкоплавкий A- богатый участок, способный облегчить фактор-независимую терминацию транскрипции. Как и в случае H. pylori, вторичную структуру, которая препятствует терминации в отсутствие рибосом, методами моделирования идентифицировать не удалось.
В случае транскрипции матрицы на основе mcc оперона Haemophilis somnus добавление рибосом никак не влияло на набор продуктов реакции in vitro транскрипции: при добавлении как смеси рибонуклеотидов, так и компонентов системы PURExpress синтезировался только полноразмерный продукт ( Рис. 19 , дорожки 5 и 6). Это может быть связано с тем, что шпилька в межгенном участке H. somnus хотя и длиннее, чем в случае P. wasabiae и P. luminescence , однако является довольно легкоплавкой: она содержит всего четыре расположенные не подряд GC пары ( Табл. 2 ). Подобная шпилька, по-видимому, не является фактор- независимым терминатором или же требует действия дополнительных стабилизирующих вторичную структуру факторов, отсутствующих в составе in vitro реакции.
Полученные в эксперименте с межгенным участком Bartonella washoensis результаты были противоречивы. Без добавления рибосом помимо полноразмерного транскрипта детектировались три дополнительных продукта примерно одинаковой интенсивности и еще один значительно более низкой интенсивности (обозначены серыми стрелками на Рис. 19 , дорожка 7). Один из дополнительных продуктов находился на электрофореграмме выше полноразмерного транскрипта, соответствующего дочитыванию РНКП до конца ДНК-фрагмента. Появление это дополнительной полосы может быть связано с образованием какой-либо вторичной структуры, придающей аномально низкую подвижность более короткому транскрипту.
Самый низкопредставленный продукт (обозначен жирной серой стрелкой слева и справа) по своей электрофоретической подвижности соответствовал ожидаемому продукту терминации, в случае окончания терминации близко к правому плечу предсказанной шпильки. При добавлении в реакцию рибосом набор продуктов изменялся ( Рис. 19 , ср. дорожки 7 и 8). Мажорными продуктами становились полноразмерный транскрипт и предположительный продукт терминации, а содержание остальных трех продуктов значительно снижалось. Таким образом, в случае B. washoensis связывание рибосомы с РНК-матрицей снижает количество остановок РНКП на ДНК-матрице, и приводит к преимущественному синтезу полноразмерного продукта и продукта терминации. В данном случае непонятно, происходит ли как таковая антитерминация в этой системе без добавления рибосомы, либо же последовательность ДНК-матрицы каким-то образом способствует паузированию РНКП E. coli, а сопряжение транскрипции и трансляции облегчает продолжение движения РНКП на паузирующих участках. Также нельзя исключить, что полученный результат является артефактом использования гетерологичной системы, и требуется проведение дополнительных экспериментов с использованием РНКП и рибосомы B. washoensis.
Таким образом, представленные первичные результаты проверки нескольких сходных с mcc опероном E. coli оперонов mcc других организмов показывают, что механизм трансляционной аттенюации - стимулированной рибосомой терминации для синтеза моноцистронного транскрипта, кодирующего пептид-предшественник McС - может быть широко распространен среди оперонов данного типа. Отсутствие сходства между последовательностями, на которых рибосома способна стимулировать терминацию транскрипции, пока не позволяет определить элементы последовательности и/или структуры, необходимые для функционирования механизма трансляционной аттенюации. Возможно, сравнительные исследования большего числа mcc-подобных оперонов позволят выявить эти элементы в будущем.
Также наши результаты демонстрируют, что существует еще один тип оперонов , таких как mcc оперон H. somnus , при транскрипции которых отдельная короткая моноцистронная РНК может вообще не образовываться, а трансляция всех генов оперонa - происходить с одной полицистронной РНК. Особенности нуклеотидной последовательности позволяют отнести к этому же типу mcc -подобные опероны Streptococcus thermophilis и Lactobacillus jоhnsonii . Выше мы продемонстрировали, что удаление шпильки из межгенного участка mcc оперона E. coli значительно снижает эффективность продукции McC . Возможно, что добавление шпильки в межгенный участок оперонов указанного типа могло бы повысить эффективность продукции ими антибиотика, по крайней мере в гетерологичных системах экспрессии, таких как клетки E. coli .
Трансляционная аттенюация - один из широко распространенных у бактерий механизмов регуляции экспрессии генов, связанный чаще всего с оперонами de novo биосинтеза аминокислот [ Kolter, 1982 ; Vitreschak, 2004 ; Yanofsky, 2004 ]. В этом типе регуляторных систем лидерная область транскрипта содержит короткую лидерную открытую рамку считывания, предваряющую структурные гены, а также две взаимоисключающие вторичные структуры в межгенной области, терминатор и антитерминатор. Формирование терминатора более энергетически выгодно по сравнению с антитерминатором, и именно терминатор формируется как при отсутствии трансляции, так и при активной трансляции этой рамки считывания [ Yanofsky, 2004 ]. Лидерный пептид содержит несколько идущих подряд кодонов, кодирующих определенную аминокислоту. Недостаток соответствующей аминокислоты приводит к остановке рибосомы на этом участке. Остановившаяся рибосома предотвращает формирование терминатора, стабилизируя антитерминаторную структуру, и происходит транскрипция нижележащих структурных генов. Лидерный пептид в таких системах играет исключительно регуляторную роль.
Описанная нами система представляет собой принципиально отличный механизм трансляционной аттенюации. В случае оперона mcc лидером выступает рамка считывания mccA , продукт трансляции которой совершенно необходим для синтеза антибиотика. В отсутствие дополнительных факторов формирование терминатора на насцентной mcc РНК блокируется, вероятно, какими-то вторичным взаимодействиями внутри mccA транскрипта, что приводит к синтезу исключительно полицистронного транскрипта. Связывание рибосомы перед открытой рамкой считывания mccA в составе насцентной РНК, напротив, приводит к стабилизации и/или появлению терминаторной шпильки и эффективной терминации транскрипции. В отличие от описанной выше канонической трансляционной аттенюации, "целью" данной системы регуляции, по всей видимости, является максимально эффективная продукция короткого транскрипта, продукт трансляции которого, гептапептид MccA , является субстратом для модификации ферментами Mcc и должен синтезироваться в избытке по сравнению с этими белками. Большая часть гептапептида MccA транслируется не с полицистронного транскрипта mcc, а именно с короткого транскрипта - об этом свидетельствует резкое снижение синтеза McC в отсутствие моноцистронного транскрипта и при неизменной концентрации полицистронной мРНК.
Описанный механизм образования моноцистронного транскрипта приводит к тому, что в клетке невозможно существование таких транскриптов, не связанных с рибосомой. Связывание с рибосомой также значительно повышает стабильность моноцистронных транскриптов. Возникает соблазн предположить, что однажды связавшись с открытой рамкой считывания mccA, рибосома не диссоциирует после завершения синтеза гептапептида, а продолжает трансляцию, "вернувшись" к началу mccA. Подобный механизм мог бы значительно увеличить эффективность трансляции короткой рамки считывания, уменьшая временной интервал между терминацией и инициацией следующего раунда трансляции.
Рибосома защищает последовательность РНК вплоть до позиции +48, а терминация транскрипции происходит в положении +104-107 mcc транскрипта. Таким образом, существует лишь небольшое временное окно для того, чтобы связывание рибосомы привело к терминации транскрипции. Поскольку формирование терминаторной шпильки может происходить уже в выходном канале РНКП [ Gusarov, 1999 ], это временное окно помещается в промежутке времени, пока РНКП перемещается от 49-го до 110-го нуклеотида матрицы. Средняя скорость транскрипции составляет 40 нт/сек [ Proshkin, 2010 ; Vogel, 1994 ] . Если в течение этого времени (порядка 1.5 c) рибосома не свяжется с РНК, терминация произойти уже не сможет, поэтому связывание должно быть очень быстрым. Возможно, что в области 49/110 существует транскрипционная пауза, которая могла бы замедлять движение РНКП на этом участке, давая дополнительное время для связывания рибосомы. В любом случае, более быстрой инициации должно способствовать наличие "сильной" последовательности Шайна-Дальгарно AGGAGG перед геном mccA, которая практически совпадает с консенсусной последовательностью AAGGAGGU [ Shine, 1974 ].
Сравнение структур ряда mcc-подобных оперонов других бактерий позволяет предположить, что открытый нами неканонический механизм трансляционной аттенюации эволюционно консервативен. В проведенных нами экспериментах с межгенными участками H. pylori , P. luminescens и P. wasabiae мы получили первичные экспериментальные подтверждения этой гипотезы. Интересно, что несмотря на сходство механизмов регуляции, проверенные межгенные участки не имеют сходства нуклеотидных последовательностей или элементов вторичных структур.
