Анализ терминации транскрипции в межгенном участке mccA-mccB
In vitro анализ терминации транскрипции в межгенном участке mccA-mccB.
Как описано выше, нам не удалось детектировать короткий транскрипт mccA в клетках, несущих оперон mcc с нарушенной последовательностью Шайна-Дальгарно перед открытой рамкой считывания mccA . Такой результат может наблюдаться в двух случаях: если свободный от рибосомы транскрипт крайне нестабилен либо если связывание рибосомы по какой-то причине необходимо для появления короткого транскрипта. Чтобы проверить последнюю гипотезу, мы провели ряд экспериментов по in vitro транскрипции и сопряженной транскрипции-трансляции.
Нам не удалось наблюдать терминацию транскрипции в межгенном районе mcc в экспериментах in vitro ни на линейной, ни на суперскрученной плазмидной матрице. Промотор Pmcc mcc оперона не является сильным промотором даже в присутствии активатора транскрипции cAMP-CAP. Чтобы повысить эффективность инициации, мы использовали химерную матрицу, где фрагмент, содержащий сильный фаговый промотор с модифицированной последовательностью начального транскрипта T7 A1 (- 67/+30) слит с начальным фрагментом оперона mcc (+1+154). Полученная химерная матрица не содержит тиминов в матричной цепи до положения +35, что дает возможность получать остановленные элонгационные комплексы, используя рибонуклеотидный праймер C(-1)pA(+1)pU(+2)pC(+3) для инициации транскрипции, ATP, GTP и 32P-альфаCTP. При добавлении UTP или смеси четырех рибонуклеотидов в реакционную смесь элонгация остановленными комплексами может быть синхронно продолжена. Как видно из Рис. 14 ,А (дорожка 2), при возобновлении движения остановленного комплекса добавлением смеси рибонуклеотидов синтезируется только полноразмерный транскрипт, а терминации не наблюдается. Если же элонгация остановленного комплекса проводилась в присутствии компонентов системы in vitro трансляции PURExpress, наряду с полноразмерным синтезировался и более короткий транскрипт, 3'-конец которого совпадал с определенным in vivo 3'-концом mccA ( Рис. 14 ,А, дорожка 5). Система PURExpress содержит очищенные компоненты, необходимые для трансляции белка: рибосомы, инициаторные и терминаторные факторы, а также смесь аминокислот, тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз. Чтобы определить, какой именно из компонентов системы PURExpress необходим для появления короткого транскрипта, мы использовали варианты системы, не содержащие либо рибосом - PURExpress дельтаRibosomes ( Рис. 14 ,А, дорожка3), либо аминокислот и тРНК - PURExpress (дельтаaa, дельтаtRNA) ( Рис. 14 ,А, дорожка 4). Как видно из приведенных данных, для появления короткого транскрипта необходимо присутствие рибосом, но не аминокислот или тРНК.
Чтобы определить место связывания рибосомы, мы провели тоупринт- анализ (toeprint) - картирование положения рибосом на РНК. При тоупринт-анализе после связывания рибосомы с РНК проводится удлинение меченого праймера, гибридизованного с РНК ниже по ходу трансляции. В отсутствие рибосомы обратная транскриптаза доходит до конца РНК-матрицы, синтезируя полноразмерную кДНК. Связанная рибосома является препятствием для обратной транскриптазы , вызывая ее преждевременную остановку и образование укороченного продукта обратной транскрипции (тоупринт), по расположению которого можно определить положение рибосомы. Даже при удлинении праймера в отсутствие рибосом обратная транскриптаза останавливалась в нескольких точках РНК mccA ( Рис. 14 ,Б, дорожка 1), что может свидетельствовать о высокой структурированности этой молекулы. Этот эффект усиливался в присутствии компонентов системы PURExpress ?Ribosome ( Рис. 14 ,Б, ср. дорожки 1 и 2).
В присутствии PURExpress (дельтаaa, дельтаtRNA) наряду с полноразмерным продуктом наблюдалась четкая полоса, соответствующая расстоянию 17/20 нт от начала открытой рамки считывания mccA ( Рис. 14 ,Б, дорожка 3), что соответствует расположению рибосомы на первом и втором кодонах mccA , соответственно [ Orelle, 2013b ]. Также наблюдались дополнительные точки остановки обратной транскриптазы вплоть до позиции +31 нт от старт-кодона mccA, соответствующие сканированию рибосомой вниз по РНК матрице. С полной системой in vitro трансляции ( Рис. 14 ,Б, дорожка 4) наблюдалось изменение набора продуктов обратной транскрипции: в дополнение к продуктам, соответствующим рибосоме, связанной с началом открытой рамки считывания mccA, появляются дополнительные продукты в положении +36 относительно старт-кодона, соответствующие рибосоме, находящейся на последнем кодирующем кодоне рамки считывания. Добавление антибиотика тиострептона , ингибирующего транслокацию [ Orelle, 2013a ], к реакциям с полной системой PURExpress приводило к накоплению продукта +17 нт, соответствующего рибосоме, находящейся на инициаторном кодоне, и исчезновению нижележащих полос ( Рис. 14 ,Б, дорожка 5).
Для дальнейшего подтверждения идеи о достаточности связывания рибосомы для стимуляции терминации транскрипции мы провели серию экспериментов на матрицах, содержащих мутации в области инициации трансляции открытой рамки считывания mccA. Использованные матрицы содержали замену старт-кодона на стоп-кодон (ATG1->TAA) либо мутации в последовательности Шайна-Дальгарно (SD) . Терминация транскрипции в присутствии полной системы PURExpress не зависит от мутации старт- кодона ( Рис. 14 ,В, ср. дорожки 4 и 5), но значительно падает на матрице с мутацией в SD-последовательности ( Рис. 14 ,В, дорожка 6). В последнем случае наблюдалась также диффузная полоса чуть выше полноразмерного продукта. По всей видимости, эта полоса соответствует нуклеолитической деградации полноразмерного продукта в присутствии компонентов системы PURExpress, так как полоса такого же размера наблюдалась при инкубации очищенного продукта транскрипции с компонентами полной системы PURExpress ( Рис. 15 , ср. дорожки 2 и 3).
Также был проведен тоупринт-анализ положения рибосомы на мутантных РНК-матрицах в присутствии системы PURExpress (дельтаaa, дельтаtRNA) ( Рис. 14 ,Г). В случае матрицы дикого типа обратная транскриптаза останавливалась в положении +17/+20 относительно старта трансляции, соответствующем расположению рибосомы на первом и втором кодонах mccA ( Рис. 14 ,Г, дорожка 2). В случае матрицы с мутациями в последовательности Шайна-Дальгарно наблюдался только полноразмерный продукт ( Рис. 14 ,Г, дорожка 6), что свидетельствует об отсутствии связывания рибосомы с такой матрицей. Замена старт-кодона на стоп-кодон приводила к уменьшению количества продукта обратной транскрипции в положении +17/+20 и появлению дополнительного продукта в положении +31 ( Рис. 14 ,Г, дорожка 4), соответствующего рибосоме, связавшейся с AUG кодоном рамки считывания, сдвинутой на один нуклеотид вправо относительно mccA (рамка считывания +1).
Приведенные выше данные позволяют предположить, что связывание рибосомы перед или внутри открытой рамки считывания mccA стимулирует формирование фактор-независимого терминатора транскрипции, срабатывание которого приводит к образованию короткого транскрипта mccA, необходимого для синтеза пептида-предшественника McC. Из этого следует, что часть транскрипта mccA, защищенная связанной рибосомой, может принимать участие во взаимодействиях, которые ингибируют формирование терминаторной шпильки. Для проверки этой идеи были проведены два типа экспериментов: транскрипция с добавлением олигонуклеотидов, предотвращающих образование вторичных структур в области перед терминатором, и делеционный анализ этой области.
При проведении элонгации транскрипции с добавлением к реакционной смеси олигонуклеотида 1, комплементарного позициям +61/+91 mccA, и, следовательно, предотвращающего формирование шпильки терминатора ( Рис. 16 ,Г), терминация транскрипции была крайне слабой даже в присутствии системы PURExpress ( Рис. 16 ,А, ср. дорожки 2 и 3). С другой стороны, при проведении реакции без добавления системы PURExpress, но в присутствии олигонуклеотида 2, комплементарного позициям mccA +26/+48, наблюдалась эффективная терминация транскрипции ( Рис. 16 ,Б, дорожка 1). Добавление олигонуклеотида 2 в реакцию имитировало действие рибосомы, вероятно, за счет предотвращения гипотетических внутримолекулярных взаимодействий, мешающих формированию терминаторной шпильки. Добавление олигонуклеотида 3, комплементарного участку mccA +51/+71, расположенному непосредственно за связанной рибосомой, также приводило к появлению продукта терминации ( Рис. 16 ,Б, дорожка 2), хотя эффект был несколько слабее, чем в случае олигонуклеотида 2. Таким образом, участок транскрипта, защищенный рибосомой при инициации трансляции совместно с лежащей дальше по ходу трансляции областью препятствует формированию терминаторной шпильки.
Чтобы более точно определить границу участка РНК, который препятствует формированию терминаторной шпильки, мы провели опыт по in vitro транскрипции без добавления рибосом с серией мутантных матриц, делетируя участки последовательно увеличивающейся длины с 5'-конца фрагмента mcc, слитого с фрагментом промотора Т7 A1 (-67+30) ( Рис. 16 ,В). При удалении до 29 нт последовательности оперона mcc наблюдался синтез только полноразмерного транскрипта ( Рис. 16 ,В, дорожки 1-3). При удалении 44 нт наблюдалась слабая терминация транскрипции, а при удалении от 59 до 73 нт терминация значительно стимулировалась ( Рис. 16 ,В, дорожки 4-6). Таким образом, участок РНК, расположенный между 30-м и 59-м нуклеотидами ниже старта транскрипции, предотвращает формирование терминаторной шпильки на насцентной РНК.
Указанный участок может препятствовать формированию терминаторной шпильки, благоприятствуя формированию альтернативной структуры. Для определения структуры транскрипта использовался метод обработки РНКазами T1 и Т2 (энзиматический пробинг), которые специфичны к неспаренным G (Т1) и всем неспаренным нуклеотидам (Т2). Транскрипты mcc без мутаций или с мутациями, нарушающими инициацию трансляции с открытой рамки считывания mccA, подвергали тепловой денатурации, а затем давали им восстановить вторичную структуру при добавлении MgCl2 или компонентов системы PURExpress. После рефолдинга транскрипты обрабатывали РНКазами. В качестве маркера длин фрагментов использовалcя транскрипт mcc, обработанный РНКазой Т1 в денатурирующих условиях. Результаты пробинга и построенная на их основании модель вторичной структуры короткого транскрипта представлены на Рис. 17 ,А и Рис. 17 ,Б. Результаты демонстрируют наличие одновременно двух шпилечных структур, первая из которых (H1) формируется сразу за связавшейся рибосомой, и имеет чувствительную к РНКазе Т2 петлю L1. Эта петля не расщепляется РНКазой Т1, поскольку содержит только A и U остатки. Следующая шпилька - терминаторная шпилька H2, ее GAUC петля чувствительна к расщеплению обоими ферментами. Вторичная структура транскриптов мутантного оперона mcc не отличалась от вторичной структуры немутантного транскрипта. Также был проведен эксперимент по пробингу вторичной структуры комплекса mcc РНК с рибосомой. Хотя связывание рибосом в целом снижает чувствительность РНК к расщеплению РНКазой Т2, что видно по увеличению содержания нерасщепленной полноразмерной РНК ( Рис. 17 ,А, ср. дорожки 7 и 8), обе области гиперчувствительности сохраняются ( Рис. 17 ,А, ср. дорожки 7 и 8, 10 и 11).
Описанные результаты не продемонстрировали заметного изменения вторичной структуры при связывании рибосомы с коротким транскриптом mccA . Чтобы продемонстрировать, что шпилька H2 в отсутствие нативного окружения способна терминировать транскрипцию in vivo, мы использовали фрагмент mccA (+71/+114 относительно старта транскрипции), содержащий эту шпильку с непосредственно прилежащими областями (7 нт выше левого плеча и 13 нт ниже правого плеча, Рис. 17 ,Б). Этот фрагмент был вставлен в прямой или обратной ориентациях в плазмиду pFD100 [ Beletskaya, 2000 ] между конститутивным промотором PlacUV5 и репортерным геном галактокиназы galK. Полученными плазмидами трансформировали клетки galK- штамма и пересевали трансформанты штрихом на индикаторную среду МакКонки. Клетки, в которых экспрессируется galK, закисляют индикаторную среду, в результате чего развивается красная окраска. Клетки, в которых не экспрессируется galK, не изменяют окраску среды. В качестве положительного контроля использовали клетки, трансформированные исходной плазмидой pFD100 , в качестве отрицательного - трансформированные плазмидой pFD51 , несущей ген galK без промотора ( Рис. 17 ,В). При высеве на индикаторную среду клетки, трансформированные плазмидой, содержащей тестируемый фрагмент оперона mcc в прямой ориентации, не меняли окраску среды, что говорит об эффективной терминации транскрипции указанным фрагментом. Напротив, клетки несущие плазмиду с фрагментом в обратной ориентации, окрашивали среду в ин-тенсивный красный цвет, как и в случае pFD100 ( Рис. 17 ,В). Таким образом, фрагмент mccA транскрипта, несущий инвертированный повтор, фланкированный 7 нт с левой и 13 нт с правой сторон, является действующим в одном направлении терминатором транскрипции in vivo.
Таким образом, мы показали, что для эффективной продукции McС клетками E. coli, несущими mcc оперон, необходимо наличие отдельного моноцистронного транскрипта, содержащего открытую рамку считывания mccA. Этот транскрипт образуется в результате терминации транскрипции в участке между генами mccA и mccB. Образование моноцистронного транскрипта контролируется механизмом трансляционной аттенюации : терминация транскрипции происходит только в случае сопряжения транскрипции и трансляции, в противном случае транскрипция идет без остановки на этом участке.
