Направленный мутагенез микроцина B
Эффективность формирования оксазольного цикла в трипептиде Gly-Cys-Ser очевидно зависит от контекста, то есть определяется аминокислотными остатками вне самого трипептида. Мы сделали попытку проанализировать влияние контекста на формирование гетероциклов с помощью сайт-специфического мутагенеза. В природе структурный ген микроцина mcbA распространяется на большой плазмиде в составе оперона, что затрудняет внесение мутаций методом ПЦР . Поэтому нами была создана двуплазмидная система экспрессии микроцина Б, в которой структурный ген mcbA , кодирующий промикроцин Б, и гены его созревания, экспорта и иммунности ( mcbBCDEFG ) находятся на двух совместимых плазмидах, причем ген mcbA находится на маленькой pUC18 плазмиде , что позволяет легко вносить любые мутации методом ПЦР. Для создания системы из природной плазмиды, несущей микроциновый оперон по рестриктным сайтам SmaI и BamHI был вырезан участок, соответствующий гену mcbA ( рис. 24 ) и клонирован в мультикопийную плазмиду pUC18. Параллельно, по сайтам BamHI и SmaI был вырезан весь микроциновый оперон (mcbABCDEFG) и клонирован в pACYC184 плазмиду . Эта плазмида совместима с плазмидой pUC18, так как несет другой ori репликации. Чтобы "выбить" ген про-микроцина из этой плазмиды, перед началом гена была внесена мутация сбоя рамки считывания . Это было сделано при помощи ПЦР вcей плазмиды с праймерами, несущими заменяемый участок. Для проверки полученной системы, плазмиды были трансформированы в клетки E. coli DH5альфа по одной или вместе. Производство микроцина наблюдалось только при котрансформации двумя плазмидами.
Для анализа влияния контекста Ser52 на циклизацию, мы сделали следующие мутации: Asn53->Gly; Cys51->Gly; инсерция двух остатков глицина между Ser52 и Asn53 (имитируя контекст двойного гетероцикла в сайте "В" ). Замена Asn53 не привела к какому-либо заметному эффекту на производство или на относительное количество разных форм микроцина. В то же время две другие мутации привели к сильному падению производства микроцина. В случае замены Cys51->Gly мы смогли обнаружить масс-ионы ожидаемой массы (m/z=3068), фрагментирующие как X и N формы микроцина .
Соответствующая хроматографическая фракция обладала антибактериальной активностью. Тем не менее, очень слабый сигнал сделал невозможным дальнейший анализ относительного количества X и N форм. В случае инсерции глицинов мы не смогли детектировать присутствие ожидаемых масс-ионов. Таким образом, остаток Asn не участвует в формировании бис-гетероцикла в сайте "С" .
Гетероциклизация цистеина оказывается важной для дальнейшего созревания микроцина, как и расстояние между разными сайтами гетероциклизации.
