Химические модификации микроцина B
Наблюдаемые на MS-MS спектрах вещества микроцин "Х" (см. Характеризация выделяемого из клеток микроцина Б ) фрагменты, в принципе, могли быть продуктами расщепления депсипептидной (сложноэфирной) связи между Cys и Ser в Gly-Cys-Ser трипептидах сайта "В" или с айта "С". Сложноэфирная связь является более лабильной, чем амидная и легче разрывается во время MS-фрагментации. Мы получили результаты, подтверждающие это предположение.
Изомеризация пептидной связи в депсипептидную приводит к образованию свободной аминогруппы. Присутствие дополнительных аминогрупп может быть выявлено с помощью химических модификаций. Мы использовали два типа реагентов для модификации "X" и "N" форм микроцина:
- пропионовый ангидрид, способный реагировать с амино- и сульфгидрильными группами, а также, с меньшей эффективностью, с гидроксигруппами и
- N-гидроксисукцинимидный эфир биотина, который является более селективным N-ацилирующим реагентом.
Так как депсипептидные связи способны изомеризоваться в пептидные при нейтральном или щелочном pH, реакции модификации выполнялись при pH 4 и при pH 7.4. Условия низкого pH являются менее благоприятными для протекания реакции ацилирования , но должны были предотвратить обратную изомеризацию депсипептидной связи в амидную связь. В случае вещества типа "N" мы рассчитывали получить моноацилированные по N-концу производные. Это предсказание выполнилось лишь частично ( рис. 17 ). С пропионовым ангидридом при обоих pH наблюдалась смесь моно- и диацилированных производных, причем при pH 7.4 количество диацилированных продуктов увеличивалось. С N-гидроксисукцинимидным эфиром при pH 7.4 наблюдались преимущественно моно-модифицированные продукты с примесью диацилированных. При pH 4 модификации N-гидроксисукцинимидным эфиром не происходило. С микроцином ( дельта+1 ), использовавшимся в качестве контроля, были обнаружены только моно-модифицированные производные, что указывало на то, что для вторым сайтом модификации обоими реагентами является Ser52. MS-MS анализ подтвердил, что микроцин (дельта+1), также как и все моно-модифицированные производные микроцина N модифицируются по N концу. Димодифицированные производные микроцина N были модифицированы по N концу и по Ser52. Этот результат являлся неожиданным, так как указывал на необычно высокую реакционную способность Ser52.
Вслед за этим были выполнены модификации вещества X. С пропионовым ангидридом при pH 7.4 были обнаружены ди- и триацилированные продукты, но не обнаружено моноацилированных производных ( рис. 17 ). При низком pH были получены моно- и димодифицированные продукты, как и в случае вещества N. Диацилированные продукты содержали модификации по N-концу и Ser52; триацилированные дополнительную модификацию по Ser67. Анализируя профили модификаций микроцинов дельта-1 и дельта-2 мы обнаружили, что Ser62 и Ser65 соответственно также могут быть модифицированы в этих соединениях. Таким образом, гидроксилы серинов в наших условиях могли быть ацилированы пропионовым ангидридом, хотя и не так эффективно.
Модификация микроцина X N-гидроксисукцинимидным эфиром биотина при pH 7.4 приводила к появлению моно- и диацилированных продуктов, тогда как модификация при pH 4 привела к появлению небольшого количества моноацилированного продукта. В среднем, сравнение представленных на рис. 17 данных показывает, что микроцин X является более реакционноспособным. Сравнение нижних панелей показывает, что при pH 4 микроцин X реагирует с N-гидроксисукцинимидным эфиром биотина с образованием производной, не наблюдаемой в случае микроцина N. На рис. 18 представлены MS-MS спектры моно-модифицированных производных микроцина X при разных значениях pH. При pH 7.4 спектр совпадает со спектром микроцина N, модифицированного по N концу, что указывает на превращение X->N во время реакции модификации. С другой стороны, производное, полученное при pH 4 обладало характерным для X-типа профилем фрагментации. Тем не менее, характерный для X-типа z-ион был смещен на 227 массовых единиц, отражая ацилирование Ser52 NHS-биотином.
Так как модификация гидроксила Ser52 в соединении N в данных условиях не наблюдалась, данный результат подразумевает наличие в данной позиции в веществе X группы с высокой реакционной способностью. В условиях эксперимента, эта группа была более реакционноспособна, чем N-концевая аминогруппа.
