Характеризация выделяемого из клеток микроцина B
Основная форма микроцина, выделяемая из клеток, содержит 8 гетероциклов: четыре оксазола и четыре тиазола. Эту форму принято обозначать в литературе как " дельта0 " [ 133 ]
Также распространены не полностью процессированные пептиды, в которых некоторые серины не циклизованы. Эти вещества не имеют одного или двух С-концевых оксазолов( дельта-1 , дельта-2 ), но тем не менее обладают антибактериальной активностью. Модификация трипептидов Gly-Ser- Cys и Gly-Cys-Ser приводит к появлению двух слитых 4,2-оксазол-тиазол ( сайт "A" ) и 4,2-тиазол-оксазол ( сайт "В" ) бис-гетероциклов ( рис. 15 ). Еще один трипептид Gly-Cys-Ser расположен между сайтами "A" и "В" - сайт "С" . Тем не менее, большинство молекул микроцина содержат в этом месте одиночный тиазольный гетероцикл.
Ser52 модифицируется лишь в небольшой фракции микроцина содержащей таким образом слитый бис-гетероцикл в сайте "С" ( дельта+1 ). Такой "гипермодифицированный" микроцин, по литературным данным, на 40% более активен чем микроцин с 8 циклами.
Финальной стадией выделения микроцина Б из культуры клеток- продуцентов является обратнофазовая ВЭЖХ . На рис. 16 представлена типичная хроматограмма, включающая три основных пика. С помощью МALDI анализа было показано, что пики 1 и 2 содержали масс-ионы со значением m/z=3094, соответствующим зрелому микроцину дельта0 ( рис. 16 ), тогда как пик 3 содержал масс-ионы с m/z=3074, соответствующие микроцину дельта+1 с дополнительным двойным гетероциклом в сайте "С". Минорные плохо разрешенные пики соответствовали незрелым формам микроцина (дельта-1, дельта-2, дельта-3). Дополнительный минорный пик, выходивший между пиками 1 и 2 также содержал масс-ионы соответствующие (дельта-1) микроцину. Таким образом, вещества, обладающие одинаковой массой, обладали разной хроматографической подвижностью. Чтобы определить причины этого необычного поведения, материал из разных фракций был подвергнут MS-MS анализу. Материал из пика 2 был однозначно подтвержден как микроцин дельта0, в то же время, материал из пика 1 обладал необычным спектром фрагментации ( рис. 16 ). Главной характеристикой этого спектра являлся очень интенсивный пик m/z=1393. Также отсутствовал Y-ион с m/z=1324 от разрыва пептидной связи между Ser и Asn. Масс-ион m/z=1393 не мог быть сопоставлен ни с одним из продуктов возможного расщепления пептида. Ближайшим соответствием являлся ион m/z=1395, являющийся продуктом расщепления N-Cальфа (Ser52) связи. Возможный парный N-концевой ион с массой 1702 был также обнаружен. В дальнейшем мы будем обозначать микроцин со стандартным характером фрагментации как микроцин "N" , а микроцин с характерным интенсивным разрывом - как микроцин "Х" .
Существование сайта предпочтительной фрагментации указывало на наличие значительно более лабильной связи, чем пептидная. Масс-ионы, соответствующие вариантам микроцина (дельта-1), по-разному ведущим себя на хроматографии, были также проанализированы с помощью тандемного MS. В обоих случаях отсутствовал С-концевой оксазольный гетероцикл, что могло быть детектировано по увеличению массы игрек в 7-ой степени иона на 20 единиц. Материал с большим временем удерживания обладал типичным спектром фрагментации, материал с меньшим временем удерживания - аномальным спектром, содержавшим интенсивный пик фрагментации (m/z=1413, т.е. 1393+20) ( рис. 16 ).
Материал, соответствующий веществам (дельта-2) и (дельта-3) был также проанализирован ( рис. 16 ); было обнаружено, что он не содержит двух или трех С-концевых оксазолов (что следует из сдвига на 20 и 40 единиц масс-иона игрек в 10-ой степени). В этом материале также были представлены интенсивные пики m/z=1413 и m/z=1434. Анализ фрагментации формы (дельта-3) также выявил фрагмент m/z=1112, который мог являться продуктом расщепления N-Cальфа связи Ser56 (ожидаемая масса z в 15-ой степени иона - 1114). Соответствующий парный N-концевой ион был также обнаружен. Ser56 при обычных условиях входит в бис-гетероцикл сайта "В", но в (дельта-3) форме остается недоциклизованным. Таким образом, структура сайта "В" в веществе (дельта-3) (тиазольный цикл, за которым следует серин) идентична структуре сайта "С" в веществе дельта0. Можно предположить, что модификация трипептидов Gly-Ser-Cys McB-синтазой в некоторых случаях приводит к образованию необычной структуры, не описанной в литературе. Во время тандемной масс-спектрометрии эта форма микроцина образует фрагменты, не характерные для расщепления обычных пептидных связей. Более 60% молекул микроцина, выделяемого из клеток, находится именно в этой форме.
